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小龙虾腿部伸肌上高输出与低输出神经肌肉接头的生理记录

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DOI：

10.3791/2319

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2010年11月17日

 , 
1Department of Biology, University of Kentucky

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文演示了如何在螯虾行走腿的伸肌上进行突触反应的电生理记录，以及如何对神经末梢进行可视化，以显示高输出和低输出神经末梢在宏观形态上的差异。

摘要

我们详细说明如何暴露并记录螯虾行走腿伸肌中支配高（时相性）和低（紧张性）输出运动神经元的突触反应的电生理记录方法。时相性和紧张性神经末梢在生理和形态上存在显著差异。紧张性轴突含有更多的线粒体，因此比时相性轴突能更强烈地摄取活体染料。紧张性末梢具有膨大结构（varicosities），而时相性末梢呈丝状。紧张性末梢的突触效能较低，但表现出显著的易化反应；相反，时相性末梢的量子化释放效能较高，但在高频刺激下出现突触抑制。通过将局灶性大电极直接放置在可视化神经末梢上方，可测量其量子化输出。时相性和紧张性末梢共同支配相同的肌纤维，这表明神经元本身的固有差异，而非来自肌肉的差异性逆行反馈，是导致其形态和生理分化的根本原因。

方案

1）引言

运动神经元在突触处与肌纤维进行通信，这些突触 collectively 被称为神经肌肉接头（NMJ）。在大多数螯虾肌肉制备标本中，NMJ易于观察和研究。许多螯虾的NMJ表现出非峰电位的兴奋性突触后电位（EPSP），类似于哺乳动物中枢神经系统突触后树突中产生的分级电信号，或在脊椎动物NMJ中观察到的阈下反应（Wiersma & Van Harreveld, 1938；Katz & Kuffler, 1946）。因此，螯虾NMJ可作为基础突触模型，为突触传递和突触分化的普遍机制提供重要见解。

通常，运动单位通过神经肌肉接头（NMJ）处的突触传递类型以及肌肉的特性来调控动物行为的各个方面。自从首次在蟹和螯虾的闭肌中观察到“快”和“慢”肌肉收缩现象以来（Lucas, 1907, 1917），类似的肌肉收缩分化也已在其他类型的螯虾肌肉中得到描述，例如腹部屈肌（Kennedy & Takeda, 1965a, b）和附肢伸肌（Van Harreveld & Wiersma, 1936）。“快”收缩引发快速反应，例如螯虾的尾部翻转即为一种快速行为。“慢”收缩则维持缓慢运动并有助于姿势保持（Bradacs et al., 1997）。与“快”和“慢”肌肉收缩相对应，“成簇/高输出”和“紧张性/低输出”这两个术语被广泛用于描述运动神经元。肌肉收缩频率和时序的差异部分源于突触前结构和突触强度的差异（King et al., 1996）。肌原纤维蛋白异构体的表达在收缩差异中也具有重要作用；但在某些制备样本中，例如腿部伸肌，单根肌纤维同时接受两种类型的运动神经元支配，因此研究重点在于神经末梢的突触差异，因为这些末梢共享同一个靶细胞（Mykles et al., 2002）。早期研究曾分析了腿部伸肌的两条兴奋性运动轴突，并描述了其成簇型和紧张型表型（Bradacs et al., 1997）。在本报告中，我们演示了如何进行解剖并获取记录，以便其他研究人员能够进一步探究这些神经末梢突触分化的特性。

通过透射电子显微镜观察，从螯虾腿部伸肌上获取的紧张型和时相型神经末梢的连续切片系列显示，紧张型末梢中的RRP囊泡数量多于时相型末梢；紧张型神经元中的线粒体更为丰富，而时相型末梢上的突触比低输出型突触更为复杂，因其含有多个活性区且间距各异（Miller et al, 2002；Johnstone et al., 2008；King et al., 1996；Bradacs et al., 1997）。此外，低输出的紧张型末梢在神经调质5-羟色胺（5-HT）作用下增强突触传递的能力也强于时相型末梢（Cooper et al., 2003）。

紧张性突触和时相性突触存在于同一肌纤维上，这一特点使得在同一肌纤维上评估突触前差异，以及研究肌肉疲劳、突触抑制和突触间串扰等问题变得更加容易。该制备模型中仍存在诸多尚未解决的问题，例如紧张性和时相性神经末梢的突触后靶区是否存在突触后受体密度或谷氨酸受体亚型的差异。然而，对这两种运动单位在解剖学和生理学上的基本差异获得更深入的理解，将有助于建立更为扎实的知识体系。希望在此突触制备模型中获得的基本原理能够适用于其他制备模型中的突触，并推动未来对螯虾突触模型的进一步研究。

2）方法

  1. 所有实验均在中等体型的克氏原螯虾（Procambarus clarkii）的第一或第二步足上进行。动物被单独饲养在装有充氧水的塑料容器中。动物饲养室的温度保持在13°C–16°C之间。每周喂食一次干燥鱼粮，并更换水。

    甲壳类步足解剖图，标注各节段：基节、腕节、指节。
    图1： 克氏原螯虾步足示意图及远端六个节段。
  2. 克氏原螯虾步足的远端在解剖学上分为六个节段（图1）。伸肌位于腕节内，而待分离的神经束靠近腕节与坐节之间的关节。在暴露后，可根据生理实验需要选择性刺激紧张性或时相性轴突。
  3. Cooper 和 Cooper（2009年）描述了部分初始解剖步骤，包括在腕节区域暴露开肌运动神经元兴奋支的方法，但其描述未涉及保护伸肌免受损伤的必要操作，因为该研究无需保留伸肌。为保护伸肌，需从体长6–10 cm的克氏原螯虾（Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA）上取下第一或第二步足，方法是用力夹持坐节节段断裂面远端，诱导动物自切肢体。将步足放置于解剖板上，使外侧（外侧面）朝向观察者。旋转步足，确保其外侧（外侧面）朝上放置于解剖板，通常以弧形面朝上（图2）。将步足置于一张滤纸上，有助于在切割过程中翻转标本。

    甲壳类解剖图，外骨骼节段标注图，外侧视角用于研究。
    图2： 腕节的外侧（通常为弧形面）朝上放置于解剖板上。
  4. 使用手术刀片折断器及刀柄，以锋利的剃须刀片沿图3所示模式在腕节节段的角质层上刻划，直至刚好切透。注意在腕节–掌节关节处进行背侧至腹侧切割时，远端切口不宜过长。

    昆虫触角形态图；突出显示分节结构；昆虫学研究。
    图3： 腕节节段，图中线条为建议刻划角质层窗口的路径。


    将标本置于生理盐水中。解剖皿底部应涂有一层Sylgard（Dow Corning）材料（厚度1 cm）。使用Sylgard可插入昆虫针以固定标本。此时，将一根针插入掌节节段中央，另一根针插入坐节节段的背侧（图4）。解剖后的标本浸浴于标准克氏原螯虾生理盐水中，该盐水经Van Harreveld溶液（1936年）改良，成分为：205 NaCl；5.3 KCl；13.5 CaCl2·2H2O；2.45 MgCl2·6H2O；5 HEPES，用mM单位表示，pH值调至7.4。


    静态平衡，毛发湿度计装置用于湿度测量；毛发张力，水分吸收。
    图4： 腕节节段，角质层窗口已被掀起。注意解剖针的位置。
  5. 在远端区域轻轻掀起角质层，并通过向腿基部方向划切，将肌纤维与角质层分离。随后可将角质层完全掀开。
  6. 在腕节–掌节关节处切断腱（附着腱）。在屈肌腱内表面插入一根针，以标示切割位置（图5）。然后用镊子夹住已切断的部位，向尾侧方向提起，将屈肌剥离（图6），从而暴露主腿神经和伸肌。

    解剖步骤，特写图，神经刺激实验，生物医学研究。
    图5： 用针将屈肌腱从屈肌上移开，以突出显示其位置。


    多毛纲海洋蠕虫，显微镜图像，可见刚毛细节，用于海洋生物学研究。
    图6： 小心切断并移除屈肌腱，避免损伤主腿神经。
  7. 在腕节–掌节关节处切断主腿神经，并小心地将其向伸肌上方回拉。本研究始终使用肌肉的内侧面。通过轻轻将主腿神经远端残端拉向标本一侧，可更清晰地分离伸肌神经与主腿神经。在将主腿神经从伸肌上剥离时，可能需要切断一些小的轴突分支，这些是伸肌的抑制性运动神经元的分支。在腕节近端附近从主腿神经分出的较粗神经束即为本研究关注的目标小神经束。

    解剖的蚯蚓，显示内部器官，生物学教育图，用于解剖学研究。
    图7： 主腿神经被切断并向近端方向回拉。


    该神经束可通过亚甲蓝染色（图8）或4-Di-2-ASP荧光染色（图9）观察。


    通过光学显微镜观察植物木质部；显示清晰方向性流动的汁液运输通道。
    图8： 伸肌经亚甲蓝染色。注意神经内的轴突分支及两条清晰可见的轴突。红色箭头标示神经走行路径。


    肌肉纤维显微镜图像，显示时相性和紧张性区域，用于肌肉活动分析。
    图9： 运动神经轴突经4-Di-2-ASP染色。由于线粒体含量较高，紧张性轴突染色更亮。


    神经元结构，显微镜图像，10微米比例尺，生物研究，细胞形态分析。 图10A： 经4-Di-2-ASP染色的时相性和紧张性神经元的单个终末。注意紧张性终末上的串珠样膨大以及时相性终末的纤细形态。


    神经元显微镜图像；10 μm比例尺；轴突结构可视化。
    图10B - 标注紧张性


    时相性神经元结构，显微镜图像，10 µm比例尺，突出显示神经通路。
    图10C - 标注时相性

3) 生理特征分析

  1. 为了观察紧张性或时相性神经元的兴奋性突触后电位（EPSPs），可通过连接至Grass刺激器的负压电极（图11）刺激神经束中的一条分离轴突，同时记录肌肉内的细胞内电位（Johnstone et al., 2008）。为促进低输出神经肌肉接头（NMJs）产生易化反应，需以70 Hz频率刺激紧张性轴突；而为获得高输出NMJs的大EPSPs，则对时相性轴突施加单次脉冲刺激（1 Hz），如图12所示。EPSPs通过PowerLab/4s接口记录至计算机。

    用于细胞结构研究的具有条纹分析的肌纤维显微镜图像。
    图11： 置于神经束内单根轴突上方的刺激电极。注意绿色线条标出了两条主要轴突。


    电生理图；显示70 Hz下紧张性-时相性电活动，2 mV刻度。
    图12： 通过细胞内记录获得的紧张性或时相性神经元的突触后电位（EPSPs）。
  2. 可利用低输出和高输出神经肌肉接头（NMJs）采用多种实验范式研究突触易化与突触抑制的性质。低输出NMJs的易化效应依赖于刺激频率，如在约20次刺激下20、40和60 Hz脉冲所显示的结果（图13）。

    电生理图，显示在20Hz、40Hz、60Hz下随时间变化的神经反应（mV）。
    图13： 在正常螯虾生理盐水中，以三种不同频率（20、40和60 Hz）施加一串刺激脉冲后产生的EPSPs。
  3. 高输出NMJs的突触抑制速率也与刺激频率相关。图14显示以持续5 Hz频率刺激30分钟导致NMJ逐渐抑制。随着刺激频率升高，标本的抑制发生得更快（Bradacs et al., 1997）。

    EPSP幅度随时间变化图，突触反应分析，刺激频率为0.5Hz、5Hz。
    图14： 以5 Hz刺激诱导抑制期间时相性反应的EPSP幅度。

4) 量子化反应

  1. 采用与描述的小龙虾开肌方法（Cooper和Cooper，2009）相似的步骤进行本实验制备。通过将大斑块记录电极的尖端置于用活体染料4-Di-2-Asp显影出的突触膨大处，直接记录可识别神经末梢单个释放位点上的量子化兴奋性突触后电位（EPSPs）。5 μM，5分钟处理，Cooper 等，1995；Magrassi 等（1987年）。可沿神经末梢记录到自发性和诱发性量子化反应。诱发性和自发性突触电位通过大斑块电极记录（Dudel，1981；Wojtowicz） 等，1991；Mallart，1993）。Kimax 玻璃管（外径：1.5 mm）经拉制并火焰抛光，制成内径为 10 至 20 μm （图15）。

    用于细胞研究中基因编辑的显微注射技术示意图，含微量移液器。
    图15： 大膜片记录电极的内腔。


    电极腔内充满灌流液。放大器与上述细胞内记录所用的相同。可通过向电极施加测试电流脉冲来测定电极电阻和封接电阻。在我们的实验中，封接电阻范围为0.3至1.0 MΩ，电极电阻范围为0.5至1.0 MΩ。在整个记录过程中可持续监测封接电阻。
  2. 低刺激频率下可直接计数量子事件。对于每次诱发反应，低输出终端的量子事件数量可轻易确定（图16）。这些直接计数有助于估算平均量子含量（Del Castillo & Katz，1954；Cooper 等，1995）。由于诱发的高输出型神经肌肉接头（NMJ）会产生多囊泡诱发事件，因此可通过诱发反应偏转的平均幅度或面积，以及自发事件的平均峰值幅度或面积，来估算平均囊泡含量（quantal content）（Cooper 等., 1995).

    神经元EPSP波形图，显示时相性和紧张性反应，标注mEPSP，持续时间为10毫秒。
    图16 从一个时相性和一个紧张性神经肌肉接头记录的局部电位轨迹。

    平均量子含量分析公式，诱发性与自发性量子事件的方程。
    图17

讨论

本报告中，我们展示了如何在一个独特的螯虾神经肌肉标本上进行突触反应的分离、记录和量化，该标本中高输出和低输出的神经末梢共同支配同一条肌纤维。与脊椎动物的神经肌肉接头相比，螯虾的神经肌肉标本具有诸多优势：仅需少数几个兴奋性运动神经元即可支配一块肌肉，且神经元在不同制备样本之间具有可识别性（Atwood, 1976）。此外，其兴奋性神经递质为谷氨酸，兴奋性突触后电位（EPSP）呈等级性变化，因此这种等级性事件的生物物理特性与脊椎动物中枢神经系统（CNS）神经元树突的特性相似。然而，量子化电流可直接在突触后位点进行监测（Cooper et al., 1995）。

对时相性神经施加重复的 5 Hz 刺激会引发较大的兴奋性突触后电位（EPSP），但在数分钟后这些电位会显著减弱。这种类型的突触抑制在节肢动物的时相性神经肌肉接头中较为常见（Atwood 和 Cooper，1996）。由于紧张性末梢与时相性末梢并存，研究者可借此评估在时相性运动神经元发生抑制期间及之后，突触后靶细胞是否发生了显著改变。此外，低输出型末梢为研究突触易化背后的机制提供了一个理想的实验体系（Desai-Shah 等，2008；Desai-Shah 和 Cooper，2009）

高输出端为研究突触抑制速率的调制及其恢复过程提供了理想的实验平台。可及且存活良好的标本有助于阐明突触抑制背后的机制。在此螯虾腿部伸肌标本中，外源性施加5-羟色胺是研究突触抑制恢复的另一种工具，也可能为进一步探究突触囊泡池的动员机制提供手段。该标本具有多种实验优势，因为单个肌纤维同时受到时相性和紧张性运动神经元的支配。

由于5-羟色胺能够增加在诱发刺激下释放的囊泡数量，并且在突触抑制期间促进功能恢复，显然5-羟色胺的存在会对囊泡池进行某种调节，从而提高囊泡融合的概率（Johnstone et al., 2008；Logsdon et al., 2006；Sparks et al., 2004）。在该实验体系可采用的各种实验方案中，还需考虑能够解释低频刺激条件下、而非抑制状态下，突触前神经末梢内囊泡池动态变化的模型。

在其他系统中已发现，约30%的囊泡池经历快速再循环，而其余回收的囊泡则通过内质网进行传统的慢速再循环路径（Harata et al., 2001；Tsien et al., 2001）。此类双重路径在此系统中也可能存在。如果突触前末梢处于抑制状态时缺乏ATP，则停靠与解离过程可能无法进行，从而导致更多未装载的囊泡滞留在突触表面。由于当末梢暴露于5-HT时会迅速释放更多囊泡，因此可以推测在可立即释放囊泡池（RRV）中包含的囊泡数量更多。然而，在ATP减少的抑制状态下，即使存在5-HT，停靠与解离过程仍可能被阻断，这再次导致未装载的囊泡滞留在突触表面。由于初步数据表明，随着5-HT长时间暴露和刺激，随时间推移释放的囊泡数量增加，因此来自快速和慢速再循环路径的囊泡池分布可能偏向于具有可再次释放能力的成熟囊泡（来自Johnne et al., 2008；参见综述—Desai-Shah et al., 2008；Desai-Shah和Cooper，2009）

通过聚焦大斑片记录突触后电流的技术以及从运动神经末梢特定区域测量单个量子事件的方法，可以探究突触抑制的发生是由于释放的囊泡数量减少，还是由于突触后受体功能的改变所致。已有研究表明，在相同的钙暴露条件下，该制备模型中紧张型神经肌肉接头（phasic NMJ）的囊泡对融合更为敏感（Miller et al. 2005），这很可能解释了紧张型末梢具有较高的平均量子含量的原因（Msghina et al., 1998, 1999）。此外，钙结合蛋白frequein的差异（Jeromin et al., 1999）以及超微结构的不同（King et al., 1996）也共同导致了突触效能的差异（Cooper et al., 2003）。

一些先前的研究已探讨了伸肌纤维的肌肉表型（Bradacs et al., 1997；Cooper et al., 2003）。将龙虾中完全张力型和时相型纤维类型的肌肉分化调控与混合型纤维类型（如受低频神经支配的腿部伸肌）进行比较，可能为肌肉表型的表达与调控机制提供线索（LaFramboise et al., 2000；Sohn et al., 2000；Griffis et al., 2001；Mykles et al., 2002）。

神经生物学领域仍有许多基本问题有待解决，而该实验准备可能有助于探讨其中部分问题。当前该领域内一些值得关注的研究方向可借助腿部伸肌系统进行探究，包括：1）确定高输出突触末端突触抑制现象背后的细胞机制（抑制是否源于Ca2+内流减少、缺乏足够数量的可立即释放囊泡（RRV）池，和/或突触后敏感性改变？）；2）明确5-HT在突触抑制诱导后促进恢复速度的机制性作用；3）确定在诱导抑制过程中，由刺激时相性末端引发的量子化电流波形是否发生变化，以区分突触前与突触后成分在突触抑制中的贡献。

该神经肌肉接头对于当前的研究和未来的科研人员具有重要意义，因为它使我们能够获得与突触传递性能相关的关键信息，这些信息是直接在递质释放位点测得的。该领域的现有研究正在揭示5-HT对突触抑制的调节作用以及囊泡池的动力学特性。这些课题涉及所有神经系统中突触传递的基本原理。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

感谢肯塔基大学英语系 Craig D. Slaven 先生提供的编辑协助。本研究由肯塔基大学生物学系、本科教育办公室及文理学院资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
  1. 小龙虾（Procambarus clarkii），购自美国路易斯安那州拉塞尔县阿查法拉亚生物供应公司（Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA）。
  2. 标准小龙虾生理盐水：
    • 参照 Van Harreveld 溶液（1936 年）改良配制（单位：mM）：205 NaCl；5.3 KCl；13.5 CaCl2·2H2O；2.45 MgCl2·6H2O；5 HEPES，调节 pH 至 7.4
  3. 解剖工具：精细 #5 镊子、精细剪刀、刀片夹持器、#26002-20 昆虫针（以上均购自 Fine Science Tools (USA), Inc.，地址：373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139，美国）
  4. 涂有 Sylgard 的解剖皿，记录用培养皿可采用带负压电极的装置，或使用负压电极与另一操纵器固定负压电极。
  5. 用于细胞内记录的体视显微镜，需具备变焦功能。对可视化末梢进行局灶记录时，使用配备直立物镜（4× 和 20×）的复合显微镜。需配备 Hg 光源。
  6. 标准细胞内放大器及用于在线记录至计算机的 A/D 转换板。电信号通过 PowerLab/4s 接口（ADInstruments，澳大利亚）在线记录。我们使用 ADInstruments 公司提供的标准 Chart 或 Scope 软件。
  7. 化学试剂：
    • 我们使用一种活体荧光染料——4 [4-(二乙氨基)苯乙烯基]-N-甲基吡啶碘化物（4 Di 2 Asp；Molecular Probes，尤金，俄勒冈州），用于可视化神经末梢的曲张体（Marigassi et al., 1987；Cooper et al., 1995a）。所有生理盐水中的化学试剂均购自 Sigma 化学公司（St. Louis, MO，美国）。
  8. 用于细胞内记录的玻璃毛细管（美国缅因州不伦瑞克 FHC 公司产品，目录号 #30-31-0）；用于局灶大电极记录的 Kimax-51 玻璃管（Kimble Products，货号 34502，内径 0.8–1.1 mm，长度 100 mm）。细胞内电极的电阻应为 20 至 30 mΩ。大电极通过电极拉制仪拉出细尖后将其尖端折断制备而成，折断处应为直径约 20μm 的平整垂直断面。随后将尖端加热抛光至内径约 10μm。再将电极杆部通过加热元件加热，使其缓慢弯曲约 45 度。这样在微操纵器以约 45 度角操作时，电极腔面可与神经末梢保持水平或垂直。

参考文献

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小龙虾腿部伸肌上高输出与低输出神经肌肉接头的生理记录
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