本实验为学生提供了一种简便的方法，以获得观察肌肉结构、突触反应以及离子梯度和通透性对膜电位影响的经验。此外，还展示了一个感觉-中枢神经系统-运动-肌肉环路，用于演示测试化合物对神经环路作用的方法。
方法文章
利用螯虾进行膜电位、突触反应、神经回路、神经调制及肌肉组织学的学生实验
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
本报告旨在帮助理解生物膜两侧离子梯度所引起的作用。影响细胞膜电位的两个方面，也是本实验所探讨的内容：（1）膜外K+的离子浓度；（2）膜对特定离子的通透性。小龙虾腹部伸肌肌肉成群分布，其中一些属于紧张性（慢速）类型，另一些则属于时相性（快速）类型，它们在生化和生理表型以及结构上均存在差异；支配这些肌肉的运动神经元在功能特性上也相应不同。我们利用这些肌肉以及浅层的紧张性腹部屈肌来演示突触传递的特性。此外，我们引入一个感觉器-中枢神经系统-运动神经元-肌肉回路，以演示体壁感受器刺激的作用，以及神经调质对该回路某些方面的调控影响。通过本实验所掌握的技术，研究者可开始解答其他实验体系中尚存的问题，以及与医学和健康相关的生理学应用问题。我们已证明，无脊椎动物模型在探讨适用于所有动物的基本科学问题方面具有重要价值。
方案
1. 引言
这些实验的目标是理解可兴奋膜的特性、静息膜电位的离子基础以及测量膜电位的方法。此外，还介绍了肌肉的染色与组织学技术，可用于讲授肌肉结构。同时，采用两种不同的离体标本，以演示不同肌群中突触传递的特性。实验还利用小龙虾腹部完整的感受器-中枢神经系统（CNS）-运动神经元-肌肉环路，建立一种可用于研究感觉刺激以及神经调质和神经递质对环路功能影响的实验标本。
本报告的第一部分介绍了用于测量静息膜电位以及细胞外K+对膜电位影响的方法。我们还将介绍肌肉的结构。在本实验的第二部分，我们将展示从不同类型神经肌肉接头（NMJs）记录突触反应的多种方法。第一个实验采用螯虾腹部伸肌肌肉，第二个实验则使用腹部浅层屈肌肌肉。此外，我们介绍了一个易于维持的神经回路（螯虾的腹神经索，包含感觉输入和运动输出），该回路可用于教学，也可用于感觉-中枢神经系统-运动神经元-肌肉回路多个方面的研究。在完成初始实验的讲解后，我们将进一步阐述神经肌肉接头和中枢神经系统回路的生理学特性。
生物膜两侧的离子梯度可导致电位差。细胞处于静息状态时，细胞膜两侧的电荷差异称为细胞的静息膜电位。影响细胞膜电位的因素主要有两个：一是膜两侧的离子浓度；二是膜对离子的通透性。需要注意的是，在活细胞中存在多种不同的离子，其在细胞内外的浓度各不相同。我们将重点讨论的关键离子包括钠离子（Na+）、钾离子（K+）和氯离子（Cl⁻）。这些离子在肌细胞膜上的数量及其跨膜移动决定了膜电位。在此基础上，我们可以进一步探讨由突触反应引起的膜电兴奋和电抑制过程中所观察到的电位变化，并研究药物制剂的作用效果。此外，我们还可以建立生物物理模型，以实验验证这些过程的相关概念（Robinson et al., 2010）。
使用玻璃毛细管微电极可记录膜电位。只要电极尖端足够细小，便可将电极插入细胞膜而不会造成损伤，并能准确测量跨膜电位。该技术特别适用于较大的细胞，因为大细胞在插入细胞内电极时较不易受损。这是生理学中的一项基本技术。
在生理条件下，膜内外 Na+ 和 K+ 的平衡由 Na-K ATP 酶泵维持。在正常情况下，该泵平均每次将三个 Na+ 移出细胞，同时将两个 K+ 移入细胞。附带一提，这一发现最早于 20 世纪 50 年代末期取得，其相关研究在 1997 年获得了诺贝尔化学奖。该发现的基本原理来源于对蟹类轴突的研究（Skou, 1965, 1998）。
由于该泵在膜去极化时具有更强的泵送能力，因此也被认为是生电性的（Skou, 1989a,b）。在许多细胞中，当细胞因去极化而发生电激活时，泵的活动会加快。
细胞处于静息状态时，钾离子也可以通过钾“漏”通道移动。由于这些钾漏通道的存在，细胞膜在静息状态下对钾离子的通透性高于其他离子。因此，细胞的静息膜电位更接近于钾离子的平衡电位，而非钠离子的平衡电位。由此可以考察静息膜电位是否依赖于钾离子的平衡电位。
1) 肌肉变异性
甲壳动物肌肉纤维在结构特征、膜电学特性以及收缩特性方面表现出比脊椎动物肌肉纤维更大的变异性。甲壳动物中的相位型肌肉纤维特化为产生抽搐式收缩，其特征包括较短的肌节长度（2–4 微米）、细而直的Z线、细肌丝与粗肌丝的比较低，以及发达的横小管系统和肌浆网系统。相位型肌肉纤维膜可产生分级电位或“全或无”动作电位。而紧张型肌肉纤维则特化为维持长时间张力，其肌节长度通常为10至15微米，Z线较厚且呈波浪状，细肌丝与粗肌丝的比较高，横小管系统和肌浆网系统发育程度较低。紧张型肌肉纤维膜通常电不可兴奋，或可产生分级电反应（“分级锋电位”）。在甲壳动物肌肉中还存在大量介于两者之间的中间型肌纤维类型。
2）方程式
常用于确定离子平衡电位和静息膜电位的方程分别为能斯特方程和戈德曼-霍奇金-卡茨（G-H-K）方程。这两个方程之间的一个重要区别在于，能斯特方程仅用于一种特定离子，以确定该离子的平衡电位；而G-H-K方程则通过考虑多种离子的通透性及其跨细胞膜的浓度梯度，用于确定静息电位（Nernst, 1888, 1889；Goldman, 1943；Hodgkin 和 Huxley, 1952；Hodgkin et al., 1952；Hodgkin 和 Katz, 1949；参见 Hille, 1992）。
能斯特方程通常用于描述离子跨膜产生的电动势，其常见表达式为：
V= (RT/zF) ln([X]out/ [X]in)
X = 待测离子
V = 膜上X离子的平衡电位
R = 气体常数 [8.314 J/(mol•K)]
T = 绝对温度 [开尔文]
Z = 离子价态
F = 法拉第常数 [9.649 x 104 C/mol]
对于 20°C 下的 K+ 离子，将 Ln 转换为 Log10 并代入常数后可得：
电位 = 58 log ([Kin]/[Kout])；单位为 mV
假设仅有 K+ 离子可通过扩散通透。[Kin] 表示细胞内的 K+ 离子浓度，[Kout] 表示细胞外的 K+ 离子浓度。
作为练习，估算 [Kin]。 ______________
假设在本计算中，膜电位仅取决于 K+ 的平衡电位。
已知所用生理盐水中 [Kout] 为 5.4 mM。同时假设膜电位为 -70 mV。
电位 = 58 log ([Kin]/5.4)。
在本实验中，我们将测量细胞的静息膜电位，并确定其如何受到改变细胞外钾离子浓度（[Kout]）的影响。膜电位与[Kout]之间关系的假想直线斜率为58。在采集不同[Kout]（范围从5.4 mM到100 mM）条件下的静息膜电位数据后，我们将绘制实测值，以判断其是否与假想直线相符。比较时，假想直线和实测直线均以5.4 mM [Kout]条件下测得的平均静息膜电位为起点。
考虑到细胞膜在静息状态以及不同去极化状态下可能对多种离子具有通透性，因此需使用戈德曼-霍奇金-卡茨（G-H-K）方程来考虑各种离子的通透性（方程中的 P）。如果细胞膜仅对一种离子具有通透性，则 G-H-K 方程将简化为能斯特方程。
以下是针对 Na+、K+ 和 Cl- 离子的通用戈德曼-霍奇金-凯茨（G-H-K）方程：
由于 Cl- 带负电荷，该方程中其内外浓度项是倒置的。这样便可省略 Z（离子电荷）项。
3) 本实验的目的
在本实验中，我们将测量螯虾肌肉细胞的膜电位，并应用上述讨论的原理来探讨以下问题：
- 如何使用适当的仪器和技术测量细胞膜电位。
- 肌细胞膜的离子通透性及其对膜电位的贡献。
此外，我们将初步研究肌肉结构： - 使用染色剂突出显示用于进行这些电生理实验的小龙虾腹部背侧肌肉的解剖结构。
- 观察不同类型肌纤维的组织学特征。
在本实验中，我们将使用小龙虾腹部的伸肌肌肉。这种制备方法过去已被用于讲授生理学和解剖学中的这些原理（Atwood 和 Parnas，1968）。我们采用了该文献中的许多实验步骤，并对其他部分进行了修改，以适应现有的仪器设备，并在一次3小时的学生实验课时间内完成全部实验目标。这些实验是肯塔基大学生物学系动物生理学课程中其他实验的基础（授课教师：R.L. Cooper 博士，2010年）。
4) 为何选择该模式动物
在此实验中使用螯虾腹部伸肌存在若干合理原因：
- 小龙虾通常容易获得，且在实验室条件下相对便宜并易于维持。
- 对于学习活体标本解剖技术的学生而言，该解剖操作相对简单。
- 肌肉在少量正常盐溶液中可保持稳定数小时，非常适合学生学习电生理技术。当短时间内改变外界[K⁺]时，肌肉标本也具有较好的耐受性。
- 通过刺激运动神经元，可轻松获得多种突触反应。
- 伸肌的解剖结构清晰易辨，且由于其体积较大，较容易获得稳定的细胞内记录。
- 可通过亚甲蓝染色清晰观察肌肉及其神经支配模式。此外，特定类型的肌纤维可方便地进行组织学处理，以观察肌节结构。
- 目前在美国许多机构中，无脊椎动物实验标本的使用无需经过动物实验方案审批。
2. 方法
1）材料
- 剪刀（1 个）
- 镊子（1 把）
- 银丝（用于地线，1 根）
- 显微镜（1 台）
- 电极探针（1 个）
- 底部铺有硅胶的培养皿（1 个）
- 生理盐水溶液（1 份）
- 钾溶液：5.4 mM（正常生理盐水）、10、20、40、80、100 mM
- 漂白剂（少量，用于银丝尖端制备 Ag-Cl）
- 玻璃移液管（1 支），用于移除和添加溶液
- 注射器（1 支）
- 放大器/信号采集系统（1 套）
- 法拉第屏蔽笼（1 个）
- 台式机/笔记本电脑（1 台）
- 解剖针（4 枚）
- 小龙虾
2）方法
2.1）准备/解剖：
- 应获取一只体长约 6-10 cm 的小龙虾（或大小适中的个体）。握住小龙虾头部后方，或眼睛后方约一厘米处，确保小龙虾的螯足或口器无法触及操作者。（可在切断头部前将小龙虾置于碎冰中 5 分钟以进行麻醉。）
- 使用大剪刀迅速移除头部。从小龙虾眼睛后方干净利落地快速剪断。丢弃头部及附肢。
图 1. 图像显示了移除小龙虾头部时切口的位置。 - 此时可移除小龙虾的步足和螯足，以防受伤。雄性个体的生殖足（stylets）以及雌雄个体的游泳足（swimmerets）也可一并移除（图 2）。接着，将腹部与头胸部分离。沿连接腹部与头胸部的关节膜进行剪切（图 3）。保留腹部部分，丢弃头胸部。
图 2. 剪刀正在剪除生殖足（stylets），这些结构可从小龙虾上移除。
图 3. 图像显示了从腹部上移除头胸部时切口的位置。
图 4. 从腹部上移除头胸部。切口应沿节段连接处呈环形剪开。
图 5. 上方图像显示带有游泳足附肢的腹部；下方图像显示去除游泳足附肢后的腹部。 - 针对腹部，在其外骨骼的腹侧边缘每侧沿下侧线进行切口。操作时应注意不要切得过深，以免损伤内部组织。为便于切开外骨骼，剪刀应略微朝向腹面倾斜并成一定角度进行剪切。应沿着小龙虾各体节自然延伸的壳线进行切割（图 6）。
图 6. 剪刀以倾斜角度放置，并沿外骨骼自然排列方向进行切割。切勿切得过深，以免破坏制备样本。箭头所指为各体节上应遵循的自然壳线。 - 移除外骨骼的腹侧部分，注意不要破坏腹部肌肉。使用镊子小心移除外骨骼腹侧部分。当腹侧外骨骼被移除后，可在深层屈肌上方看到一团白色组织，可用镊子小心将其去除。
图 7. 使用镊子移除外骨骼的腹侧部分。向上并向后拉扯腹侧部分以完成移除，注意不要破坏腹壳下方的肌肉。
图 8. 向后拉扯即将丢弃的外骨骼腹侧部分。
图 9. 使用剪刀剪除外骨骼腹侧部分并丢弃。 - 可将位于深层屈肌中线处的一条细小管状结构——消化道（GI tract）——从小龙虾中移除。用镊子夹住消化道顶端并从腹部方向轻轻拉出，再于尾部末端剪断其底部。用生理盐水冲洗解剖样本，以确保粪便残渣不会干扰后续实验操作。
图 10. 图像显示从制备样本中移除消化道的过程。 - 使用解剖针将制备样本固定于培养皿中。应将样本的顶部和底部角固定在皿底。向培养皿中加入生理盐水，完全浸没样本，直至进行细胞内记录实验。
该解剖用培养皿底部应涂有 Sylgard（Dow Corning）涂层（厚度 1 cm），以便插入昆虫针。
解剖后的样本浸泡在标准小龙虾生理盐水中，该溶液经 Van Harreveld 溶液（1936）改良而成，成分为：205 NaCl；5.3 KCl；13.5 CaCl2·2H2O；2.45 MgCl2·6H2O；5 HEPES，pH 调至 7.4（单位：mM）。
2.2）细胞内记录
图11. 记录设备的整体装置示意图。
- 应将含有标本的培养皿置于显微镜下，并用蜡固定在培养皿底部，以防止移动。
图12. 将标本置于显微镜下的示意图。使用蜡固定培养皿和标本。 - 应准备两根导线，每根导线一端连接一小段银丝。将银丝浸入少量漂白剂中约20分钟，以获得Ag-Cl涂层。使用前用清水冲洗导线。应取一支玻璃细胞内微电极，用连接注射器的长针小心地从后方填充3M KCl溶液。将微电极倒置（开口朝下）进行填充，以确保多余的KCl溶液从电极后端滴出。注意避免KCl溶液沿即将进入生理盐水浴的玻璃微电极表面流动。填充完毕后将微电极恢复直立。随后可将银丝插入微电极中。导线另一端连接至放大器头部支架的+（正极）端口。再将微电极固定在电极探针上，注意不要损坏电极尖端。将第三根连接法拉第笼的导线插入头部支架的绿色端口。最后，将另一导联的Ag丝放入浴液中，其另一端连接至下图所示的-（负极）端口。另需将一根导线从法拉第笼连接至AD转换器Powerlab的接地部分。头部支架连接至采集/放大器（Powerlab）的“输入-探针”接口。
图13. 头部支架配置示意图。连接至头部支架绿色输入端的导线应接地至放大器或法拉第笼。连接至红色输入端的导线连接至电极导线。黑色输入端用于连接浴液。
图14. “测试切换”开关位于最下一行，用于测试电极电阻。“粗调”旋钮位于直流偏移调节下方，应逆时针旋转。增益设为50，即信号放大50倍。头部支架的接地导线插入“GND”插孔。 - 应在台式机或笔记本电脑上打开LabChart软件。通过点击“Setup”，然后选择“Channel settings”，将图表调整为仅显示一个通道。在“Channel settings”中，将通道数量更改为1，点击“OK”。在图表左上角，每秒周期数应设为2K。将电压（y轴）设为约200mV至500mV。点击屏幕右侧的“Channel 1”，然后点击“Input Amplifier”，确保已勾选“Differential”选项框。
放大器输出应连接至通道1。放大器应使用以下设置：- 高通滤波-直流（DC）
- 陷波滤波-关闭（OFF）
- 低通滤波-20kHz
- 电容补偿（Capacity Comp.）-逆时针
- 直流偏移粗调和细调旋钮-逆时针
- 直流偏移（+OFF-）-关闭（OFF）
- 增益旋钮-50
- 输入（DIFF MONO GND）-差分（DIFF）
- 模式（MODE(STIM-GATE-REC)）-记录（REC）
- 电阻测试（ΩTEST）-关闭（OFF）
- 电极电阻可通过电压除以电流（2.0 nA）计算得出（即R=V/I，欧姆定律）。所得数值即为玻璃微电极的电阻。电阻值应在20至60兆欧姆（MegaOhms）之间。低于20兆欧姆（<20）或高于100兆欧姆（>100）的电阻均不可接受。确定电阻后，即可开始细胞内记录。将玻璃微电极尖端插入生理盐水浴中，并确保接地导线也置于盐水浴内。
开始记录时，点击屏幕底部的“开始”按钮。确保增益设为5 V/div。在插入电极前，使用放大器上的粗调旋钮将LabChart上的基线调至零位。通过多次切换测试开关以检测电极电阻。随后测量所得数值的幅值：在稳定基线上放置一个标记，再在峰值处放置第二个标记，以获得电极电阻值。 - 使用电极探针和显微镜将电极插入标本的纵行肌（DEM或DEL1或DEL2）中（见图16）。电极应仅轻微插入肌肉，切勿穿透肌肉。通过调节显微镜和探针设置，定位纵行肌并将电极插入肌组织。在插入电极时，应调节高强度照明器以清晰观察肌肉。在此类标本中穿刺肌纤维时，常会遇到肌肉内部的空隙或裂隙，这正是膜电位时而出现、时而消失、又再次出现的原因。
图15. 将电极插入肌肉的示意图。 - 测量膜电位时，应在插入电极前使用放大器上的粗调旋钮将LabChart基线调至零位。穿刺一条肌纤维后，测量所得数值的幅值：在稳定基线上放置一个标记并记录数值。
标记与活动光标之间的差值显示在屏幕右侧，该数值即为电压。若软件显示的数值单位为伏特（V），则记录的电压可能需要除以放大器的放大倍数（如10x或100x），并转换为毫伏（mV）（1 V = 1,000 mV）。 - 使用显微镜和操纵器小心地将电极从肌肉中撤出。穿刺另一条肌纤维并记录静息膜电位。应进行多次记录，熟悉测量方法，并能准确将细胞内电极引导至目标肌纤维。
在更换不同[K+]out浓度溶液的过程中，电极通常无法稳定停留在同一肌纤维内。最佳操作是先撤出电极，更换溶液后再重新穿刺，以避免损伤肌肉。建议每种溶液从不同的肌纤维中获取3次读数，并取平均值，以排除异常数据。 - 使用注射器将培养皿中的生理盐水溶液吸出并弃去。用下一浓度更高的氯化钾生理盐水溶液完全覆盖标本，填充培养皿。对每种钾溶液重复相同操作，并记录电压/电位的变化。我们使用的[K+]out螯虾生理盐水溶液系列浓度为：5.4、20、40、60、80、100 mM。
2.3）解剖学
生理实验完成后，我们可以观察肌肉纤维及其神经支配模式的相关解剖结构。将标本转移至染色皿中，加入亚甲蓝溶液（1克亚甲蓝溶于100 mL螯虾生理盐水）。让生理盐水浸泡标本5分钟，随后移除染色液，并加入不含染料的新鲜螯虾生理盐水。多年来，这些肌肉的解剖结构已有详细描述（Huxley, 1880；Pilgrim 和 Wiersma, 1963）。直到最近，部分肌肉才在解剖学、生理学和生物化学方面得到系统描述（Cooper et al., 1998；Griffis et al., 2000；Sohn et al., 2000）。
肌肉的一般解剖布局如图16所示（本图以右侧为例）。寻找主要支配某一节段内肌肉的主神经。绘制出该节段中SEM、DEL2、DEL1和DEM肌肉的神经支配模式。需将标本在培养皿中牢固固定，充分拉伸腹部。随后移除生理盐水，加入固定液。固定液为Bouin溶液（由饱和苦味酸、甲醛和乙酸配制而成；Sigma-Aldrich Co.）。
警告：请勿让该溶液接触皮肤或进入眼睛。应在通风橱内操作，避免吸入溶液蒸气。若眼睛感到灼痛，请立即前往洗眼站冲洗眼睛。
让Bouin溶液在标本上保留约10分钟，然后用移液器吸除并更换为生理盐水。切下一小块DEL1或DEL2肌肉，置于载玻片上。标记载玻片。对SEM肌肉重复上述操作。观察两种组织标本中的肌节条纹模式。可使用复式显微镜，并相应调节物镜以观察条纹结构。如有可能，通过显微镜目镜拍摄数码照片（注意：某些手机摄像头适用于此操作）。
图16. 从腹面观察的螯虾腹部背侧部分示意图，显示每个体节的伸肌肌肉结构。背膜腹部肌（DMA）和浅层伸肌副头肌（SEAcc）存在于腹部第1至第5节，且每节的走向不同。除第1节外，这些肌肉的前端附着于钙化的背板，后端附着于关节膜。在第1节中，同源肌肉的前端附着点位于胸腹部之间的关节膜上。该图基于亚甲蓝染色标本的显微照片拼接绘制而成。图的左侧已去除所有深层伸肌，以显示背侧浅层伸肌。比例尺 = 2.35 mm。（引自 Sohn et al. 2000）。
3. 结果
以下问题和数据处理说明了本实验操作的主要原理和目标。
- 绘制每次 [K+]出 使用。观察实际观测线与理论假设线的斜率是否一致。绘制数值时采用半对数坐标图，其中x轴表示不同浓度的[K+]出 以对数形式表示，y轴为膜电位（如下所示；图17）。（如有需要可下载免费坐标纸） http://incompetech.com/graphpaper/logarithmic/)
图17. 坐标纸
使用在5.4 mM [K+用于启动假设线与观测线的比较。
如果线条不匹配，请讨论可能的原因。 - 如果您改变了外部的 Na 水平+ 离子，您是否预期会观察到与改变 K 相同类型的改变+ 浓度？
- 亚甲蓝对肌肉的染色效果与神经相比如何？为何可能存在差异？如今亚甲蓝是否仍用于组织鉴定或活体人类细胞中的对比显影？西格蒙德·弗洛伊德与螯虾染色所用染料之间存在何种关联？
- 注意观察DEL肌与SEM肌之间肌节模式的差异。如果存在差异，可能的原因是什么？所有肌肉的静息肌节长度都相同吗？绘制你在显微镜下观察到的肌肉条带模式，并尽可能标注图中各部分结构（需与已知的肌节肌肉解剖结构相对应）。
4. 测量突触反应
1）引言
用于演示静息膜电位的腹肌标本同样非常适合演示来自不同肌肉神经肌肉接头（NMJ）突触反应的诱导。在甲壳类动物中，某些肌肉选择性地由快相或张力相运动神经元支配，尽管一些单根肌纤维可同时受到快相和张力相兴奋性运动神经元的共同支配，例如螯虾步行腿的伸肌（Atwood, 2008；参见 JOVE 产品编号 #2319-Wu 和 Cooper, 2010）以及大多数其他附肢肌肉（Wiersma, 1961a）。通过选择性刺激快相和张力相运动神经元，可测量其兴奋性突触后电位（EPSP）的生理差异。快相运动神经元引起肌纤维快速抽搐，诱发幅度约为 10–40 mV 的 EPSP。在 5–10 Hz 的刺激串作用下，快相反应可迅速发生压抑。而张力相运动神经元产生的 EPSP 幅度较小，但在较高频率（10–50 Hz）刺激下可出现易化现象。结构上，神经肌肉接头处的快相与张力相突触前终末存在差异（Atwood 和 Cooper, 1996；Bradacs et al., 1997；Cooper et al., 1998）。
令人意外的是，通过每天对时相型神经元进行数小时的电刺激，持续7天，其生理反应的表型可转变为类似紧张型的状态（Cooper et al., 1998；Mercier 和 Atwood, 1989）。此外，这种转变后的神经肌肉接头对神经调质的敏感性显著增强，非常适合用于研究受体表达的调控机制（Griffis et al., 2000）。
在这种相对稳定的制备条件下（螯虾腹部肌肉），通过不同的刺激范式，可以轻松记录和观察紧张性和时相性反应的突触反应的易化和/或抑制现象。利用这些制备样本，学生将能够通过刺激神经束来识别时相性和紧张性突触反应的一般特性。
另一种提供的神经肌肉接头制备方法用于监测来自中枢神经系统的固有运动活动以及感觉刺激诱发的运动活动。该制备标本为小龙虾腹部腹侧的浅层屈肌。此标本也将用于监测感觉-中枢神经系统-运动-肌肉环路以及神经调质的作用（Strawn et al., 2000）。
每个腹部体节（除最后一节外）均包含三组功能性肌肉：（1）控制腹肢（游泳足）运动的肌肉，（2）三块伸肌，以及（3）三块屈肌。屈肌和伸肌为相互拮抗的肌肉群，通过引起体节间关节的旋转，实现腹部的屈曲或伸展。时相性肌肉占据了腹部大部分体积，而紧张性肌肉则构成薄层状的纤维结构，分别分布于每个腹部体节的背侧（伸肌）和腹侧（屈肌）区域。
在小龙虾中，每侧体节的紧张性腹肌由五个运动神经元和一个外周抑制性神经元支配。兴奋性运动神经元以谷氨酸作为神经递质。谷氨酸通过主要增加钠离子通透性，使肌纤维发生去极化。抑制性神经元释放γ-氨基丁酸（GABA），通常通过增加氯离子通透性，使肌纤维超极化。在某些甲壳类动物的肌肉中（主要位于附肢），外周抑制性神经元不仅与肌纤维形成突触联系，还与运动神经元末梢形成突触，从而减少运动神经元释放的递质量（即突触前抑制）（Dudel 和 Kuffler，1961）。这种现象在小龙虾的紧张性屈肌中并不存在。
小龙虾的腹神经索是一种左右对称的结构，沿动物体长方向延伸。每个体节有一个神经节。在腹部（共6个体节），每个神经节包含数百个神经元，而每条连接神经（connective）由数千条轴突组成。神经元胞体在每个神经节的腹面形成数层细胞厚度的结构。在胞体层的正上方，是一层精细的神经纤维网状结构，称为神经纤维网（neuropile）。所有的突触连接均发生在此区域；神经元胞体本身则不含突触。
每个腹神经节（最后一个除外）每侧均有三条神经根。第一条神经根包含支配附肢肌的神经元轴突和感觉轴突；第二条神经根包含支配快相和张力性伸肌的轴突以及感觉轴突；第三条神经根从神经索上发出，位置位于该神经节后方数毫米处，其轴突支配快相和张力性屈肌。第三神经根分为两个分支：深支（IIIa）仅支配快相屈肌；第三神经根的浅支（IIIb）在每个半体节中含有六条轴突，支配张力性屈肌。
支配紧张性屈肌的神经元具有自发放电活性，这与时相性传出神经元不同；在制备良好的标本中，即使腹部已从动物体上取下，这些神经元仍可持续放电数小时。有关这些腹部制备标本中所取得发现的历史背景综述，参见 Atwood (2008)。在任一半体节中，支配紧张性屈肌的四个运动神经元以及一个外周抑制性神经元的胞体均位于该体节的神经节内。另一个运动神经元的胞体则位于下一个尾侧神经节中。这些神经元可根据细胞外记录的动作电位幅度可靠地区分开来。若将某一侧半体节的紧张性屈肌连同包含支配该肌肉神经元的两个神经节一并取出，通常可观察到五个神经元具有不同程度的自发放电活动。这些神经元根据细胞外记录的动作电位幅度按升序编号：f1 至 f4 为运动神经元，f5 是自发放电最显著的神经元，为外周屈肌抑制神经元；f6 是幅度最大的运动神经元，属于兴奋性运动神经元，但极少表现出自发放电。
通过外源性施加化合物，或对正在监测运动神经活动的同一节段的表皮施加感觉刺激，可以调节紧张性运动神经元活动的自发性。
2）解剖
为了获得腹部伸肌标本，需采用与上述检测静息膜电位与细胞外钾离子浓度关系相同的步骤。不同之处在于需注意位于甲壳侧缘走行的节段神经束。该神经将被吸入一个吸吮电极中，作为刺激电极。以1 Hz频率刺激以监测时相性反应；以10 Hz的短脉冲串刺激，每次持续10至20个刺激，同时监测紧张性反应。
在龙虾紧张性屈肌上进行实验的操作步骤有所不同，需要保持腹神经索完整。制备包含多个腹部体节的标本，具体操作如下：
- 应获取一只体长约6-10厘米的小龙虾（或大小适中的个体）。抓取小龙虾时，应握住其头部后方，或眼睛后方约2至3厘米处。操作过程中需确保小龙虾的螯足或口器无法触及实验人员。移除头部和附肢后应予以丢弃。
- 使用剪刀迅速切除头部。从小龙虾眼睛后方进行干净利落的快速切割。
图18. 图像显示切除小龙虾头部时切口的位置。
此时可移除小龙虾的步足和螯足，以防受伤。雄性个体的交接器（stylets）以及雌雄个体的游泳足（swimmerets）也可一并移除（见图19和图20）。接下来，将腹部与胸部分离。沿连接腹部与胸部的关节膜进行切割（见图20）。 - 保留小龙虾的腹部部分，丢弃胸甲部分。
图19. 图像显示可从小龙虾上移除的交接器（stylets）的位置。
图20. 图像显示从腹部上切除胸部时切口的位置。
图21. 从腹部上移除胸部。切口应沿节段连接线呈环形切割。
图22. 上方图像显示带有附肢的腹部。下方图像显示腹部附肢已被移除。 - 将分离出的尾部标本置于大培养皿中的生理盐水中。用大头针将尾部及标本上部固定在培养皿底部，确保标本稳固。使用解剖刀在肋骨之间的腹侧切下一块方形区域。
图23. 显示为移除标本腹侧部分应进行切割的位置。 - 应做一小切口（也可使用剪刀）。切开后将组织瓣向上掀起。随后可用剪刀将该组织瓣完全移除，以暴露深层屈肌。此过程中应使用显微镜，以确保精确去除标本的腹侧部分。
图24. 使用剪刀进行切割以暴露肌肉组织。
图25. 上方图像显示用镊子夹住组织瓣。下方图像显示在显微镜下将组织瓣从标本上移除。
图26. 浅层屈肌的暴露。
3) 细胞内记录：
图 27. 记录设备的整体装置示意图。
- 应将装有标本的培养皿置于显微镜下，并用石蜡固定在培养皿底部，以防止移动。
图28. 展示将标本置于显微镜下的操作。使用石蜡固定培养皿和标本。 - 应准备两根短银丝，一端连接导线。将银丝浸入少量漂白剂中约20分钟，以形成氯化银（Ag-Cl）涂层。使用前用清水冲洗银丝。取一支玻璃细胞内电极移液管，小心地用3 M KCl溶液充满。将移液管倒置（管口朝下）进行填充，以便多余的KCl溶液从电极后端滴出。注意避免KCl溶液沿即将浸入生理盐水浴中的玻璃管壁流动。填充完毕后，将移液管恢复直立。随后将银丝插入移液管中，另一端连接至前置放大器的+（正极）接口。将移液管固定于电极探头上，注意避免损坏电极尖端。另取一根导线一端连接法拉第笼，另一端插入前置放大器的绿色接口。最后，将另一导联的Ag丝置于浴液中，其导线另一端连接至前置放大器的-（负极）接口（如下图所示）。同时，应从法拉第笼引出一根导线连接至AD转换器Powerlab的接地端。前置放大器连接至数据采集/放大器（Powerlab）的“输入-探头”接口。
图29. 头部固定装置配置。连接至头部固定装置绿色部分的导线应接地至放大器或法拉第笼。连接至红色部分的导线与电极丝相连。黑色部分用于连接灌流液。
图30。 “测试切换”位于底部一行，用于测试电极电阻。“粗调”旋钮位于直流偏移（DC offset）下方，应逆时针旋转。增益设为50，即将信号放大五十倍。头段的接地线插入“GND”插孔。 - 应在台式机或笔记本电脑上打开 LabChart 软件。通过点击“Setup”，然后点击“Channel settings”，将图表调整为仅显示一个通道。在“Channel settings”下，将通道数量更改为 1，点击“OK”。在图表左上角，每秒周期数应设置为 2K。将电压（y 轴）设置为约 200mV 至 500mV。点击屏幕右侧的“Channel 1”，然后点击“Input Amplifier”。确保已勾选 Differential 选项框。
放大器输出应位于通道一。放大器应使用以下设置：
- 高通-直流
- 陷波滤波器-关闭
- 低通-20kHz
- 容量补偿-逆时针
- 直流偏移微调和粗调旋钮——逆时针
- 直流偏移（+OFF-）— 关闭
- 增益旋钮 - 50
- 输入（差分 单端 接地）- 差分
- 模式（STIM-GATE-REC）- REC
- ΩTEST- OFF
- 测量电极电阻时，应将电压除以电流（2.0 nA），所得数值即为玻璃电极的电阻。电阻值应在20至60兆欧姆之间。确定电阻后，即可开始细胞内记录。将玻璃电极的尖端置入盐水浴中，并确保接地导线也置于盐水浴内。
开始记录时，按下屏幕底部的“start”按钮。确保增益设置为 5 V/div。在插入电极前，使用放大器上的粗调旋钮将 LabChart 中的基线调整至零位。通过多次切换拨动开关以测试电极电阻。随后，测量所得信号的幅值。在稳定基线处放置第一个标记，再于波峰处放置第二个标记，以获得电极电阻值。 - 使用电极探针和显微镜将电极插入肌肉中，注意不要穿透整个肌肉。利用显微镜和探针的设置，定位到肌纤维的薄层，并将电极插入肌纤维内。在穿透肌肉时，可使用高强度照明器作为光源。
图31. 将电极插入肌肉。 - 必须小心操作，避免损伤浅层肌肉的神经根。
建议在实验操作过程中保持灌流盐溶液处于低温（10–15 摄氏度）并充分供氧。若无冷却装置，应定期更换为新鲜且已冷却的盐溶液。应持续向盐溶液中通入氧气或至少通入空气。 - 记录EPSP的自发活动，注意EPSP的不同幅度以及是否存在IPSP。
- 使用小号画笔非常小心地手动刺激正在监测自发活动的同一节段内的表皮边缘。注意观察反应频率是否发生变化，以及刺激表皮后是否出现此前未有的不同大小的兴奋性突触后电位（EPSPs）。
图32. 使用刺激刷和神经根进行制备。（改编自 Strawn） 等, 2000) - 刺激可在仔细更换浴液为含有神经调节剂（如5-羟色胺，1 μM）的溶液或通入CO₂的生理盐水后重复进行2注意观察特定刺激对活动谱的影响。同时观察将盐溶液换回新鲜盐溶液后，活动是否恢复至初始状态。
- 接下来，可以通过多种方式监测感觉神经-中枢神经系统-运动神经元回路中的神经活动。我们可以使用吸吮电极代替细胞内电极（图33）来记录运动神经元的活动。在玻璃制吸吮电极的尖端，套有一段塑料管，其开口大小需适中，以便将神经吸入电极尖端。开口不宜过大，否则神经容易脱落；也不宜过小，以免电极压力损伤神经。塑料管需在火焰上拉制，并修剪至所需尺寸。
图33. 使用吸电极记录装置进行设置。
将显微操作仪置于微吸电极可轻松接触盐水浴的位置。吸取盐水，直至其与微吸电极内部的银丝接触。将另一根导线置于微吸电极切口侧并靠近电极尖端，使两根导线均与盐水浴接触。
至于电生理监测，将交流/直流差分放大器（放大器）连接到 Power Lab 26T。具体操作是将 PowerLab 26T 上输入通道 1 的适当导线连接至放大器的输出端。- 放大器仪器的控制设置应调整为以下参数：
- 高通-直流
- 陷波滤波器 - 关闭
- 低通-20kHz
- 容量补偿 - 逆时针
- 直流偏移微调和粗调旋钮——逆时针
- 直流偏移（+OFF-）— 关闭
- 增益旋钮 - 50
- 输入（差分 单端 接地）- 差分
- 模式（STIM-GATE-REC）- REC
- ΩTEST- OFF
将吸电极的电线连接到前置放大器的接头。电线连接方式为：左上端接红色（正极），中间接绿色（接地），下端接黑色（负极），如图34所示。接地线可直接置于生理盐水中。
图34。 头部固定装置配置 - 放大器仪器的控制设置应调整为以下参数：
- 现在将 PowerLab 26T 的 USB 线连接到笔记本电脑。在打开计算机上的 LabChart7 之前，确保放大器和 PowerLab26T 均已接通电源并开启。
- 打开 LabChart7。
- LabChart 欢迎中心窗口将弹出。请将其关闭。
- 点击“设置”
- 单击通道设置。将通道数量更改为 1（框的左下角），点击确定。
- 在图表左上方，将每秒周期数设为约 2k，将电压（y 轴）设为约 500 或 200mV。
- 单击图表右侧的通道1。单击输入放大器。确保勾选以下设置：单端、交流耦合、反相（根据需要反转信号）和抗混叠。
- 开始记录时，请按开始键。
图35. 3的活性rd 在生理盐水（上图）和100 nM 5-HT（下图）中进行角质层刺激前后腹神经索根部的活动。刺激持续时间以横条表示。注意当标本浸泡在5-HT中时，刺激前和刺激后的活动增强（改自Strawn） 等, 2000).
我们可以从第1个st 或 2nd 通过旁路记录神经来记录根部活动；或者，我们可以将根部从腹神经索（VNC）远离处横断，记录来自外周的纯感觉输入，这些输入将向VNC传递信号。因此，为了记录感觉活动，应从横断后通向外周的根部进行记录。
2nd 背根包含来自肌肉感受器器官（MRO）的非常粗大的初级传入轴突，以及支配伸肌运动神经元的较细传出轴突（Fields and Kennedy, 1965）。其中含有大量感觉轴突st 和 2nd 根
机械感受神经元通过电突触与外侧巨大轴突（LG）存在直接连接（Krasne 1969；Zucker 1972）。此外，已知机械感受神经元可通过化学突触兴奋中间神经元。
为了研究感觉输入如何通过感觉-中枢神经系统-运动神经元环路影响运动神经元活动，我们可以在肌肉中记录突触反应。该环路的多个方面均可被检测。例如，可单独记录感觉神经根，或在感觉输入完整或缺失的情况下记录运动神经根。为分析动作电位频率的记录结果，可在不同条件下对一段时间内的放电次数进行计数。可在刷毛刺激前及给予刷毛刺激后持续一定时间进行测量（图35）。可重复该条件5次，计算频率的平均百分比变化，以此作为比较的指标。
也可以施加外源性化合物，例如血清素（serotonin，Strawn 等，2000）或多巴胺（Ach）、尼古丁或谷氨酸。已在无脊椎动物中描述尼古丁的多种行为作用，这提示存在烟碱型受体（Tsunoyama 和 Gojobori，1998）。谷氨酸在大多数无脊椎动物的神经肌肉接头（NMJ）处是一种主要的兴奋性神经递质，而乙酰胆碱（Ach）则是中枢神经系统（CNS）内的主要兴奋性神经递质（Monoghan 等，1989；Watkins， 等, 1990).
可以尝试使用庚醇或CO2 注入气泡盐水，因为它会解偶联电路中的螯虾分隔连接（或称缝隙连接），正如肯塔基大学Sonya M. Bierbower博士在其学位论文研究中所证实的。该操作可能导致螯虾整体行为在暴露于高浓度CO₂时发生改变2 在环境中（Bierbower 和 Cooper，2010）。当用刷子刺激角质层以引发感觉输入，并在运动神经元中记录反应时，注意观察在七醇或 CO 存在前后活动是否存在差异2 暴露。这可能暗示缝隙连接在感觉神经元-中枢神经系统-运动神经元环路中具有某种作用，也可能并不暗示这一点。
讨论
膜电位
早在1902年，伯恩斯坦（Bernstein）就开始研究枪乌贼轴突的静息电位问题。伯恩斯坦（1902）和能斯特（Nernst，1888）早期的思想和观察如何影响了膜生理学领域的后续研究，这一过程令人着迷。（参见Malmivuo和Plonsey于1995年的综述；该综述也可在以下网站获取：http://www.bem.fi/book/）。时至今日，关于离子通道功能及生物膜特性的研究仍不断取得突破，这些进展对于理解与组织、器官及系统功能相关的细胞生理学具有重要意义。
比较实验测定结果与理论推导的外界[K+]对静息膜电位的影响，可揭示离子对膜电位的作用。利用该相同制备标本，尚需开展更多实验以回答基本的生理学问题。其中一些问题早在1968年就由Atwood和Parnas提出，但至今仍未得到充分解决。通过本实验所掌握的技术，研究者可进一步探究其他实验制备体系中尚未解决的问题，以及与医学和健康相关的生理学应用问题。我们已证明，这种无脊椎动物模型制备标本在解答所有动物共有的基本生理问题方面具有重要价值。
通过上述实验中获得的关于离子电化学梯度的知识，你现在可以进一步研究膜的兴奋性，方法是通过观察小龙虾神经肌肉接头处的突触传递。
测量突触反应
本实验第一部分提供的详细说明及相关视频，介绍了记录膜电位和研究肌肉结构的关键步骤。在实验的第二部分，通过对快相型和慢相型运动单位神经肌肉接头（NMJ）处突触传递的解剖与记录演示，使学生接触到生理学中的一些基本概念。在完整动物体内观察神经回路，部分可用于解释相关行为，这种实践不仅有助于学生在实验课中探究各种开放性问题，也为未来利用这一成熟的无脊椎动物模型开展神经回路研究提供了可能（Kennedy et al., 1969; Antonsen and Edwards, 2003）
这些制备样本也可用于研究突触易化、突触抑制以及长时程可塑性（本实验室研究未涉及这些方面）。即使在某些龙虾物种内部，神经元可塑性也依赖于实验刺激条件（Mercier 和 Atwood，1989；Cooper et al.，1998）以及其自然环境。突触效能和肌肉动力学的可调节能力在多大程度上服务于动物本身，仍有待研究。由于龙虾会根据季节变化和蜕皮周期改变其行为，其神经肌肉系统存在相对较长时间的活动差异。研究表明，螯足闭合肌的时相性运动神经末梢在冬季表现出典型的时相性形态，但在夏季月份期间，神经末梢会肿胀，并在其全长上变得更加呈结节状（Lnenicka，1993；Lnenicka 和 Zhao，1991）。
一些早期在螯虾腹神经索的侧巨神经元（LG）中进行的研究证明了缝隙连接的存在（Johnson，1924；Watanabe 和 Grundfest，1961）。众所周知，CO2可通过解偶联缝隙连接来影响电突触通讯（Arellano 等，1990）。最近的研究表明，本报告中描述的感觉-中枢神经系统-运动-肌肉环路中的神经索及其通讯功能也对CO2暴露敏感，提示其中存在缝隙连接（Bierbower，2010；Bierbower 和 Cooper，2010）
3的自发活动rd 自20世纪60年代以来，运动根的自发活动机制一直备受关注。Eckert（1961）曾探讨同节段或邻近节段中张力性放电的静态肌肉受体器官（MRO）是否可解释这种自发性运动驱动。早期研究表明，该活动可能由腹神经索（VNC）内部产生，或源自更高级的中枢（Eckert，1961；Kennedy和Takeda，1965a,b；Strawn） 等，2000）。由于 CO 的存在2 停止了自发性活动后，可以推测在向运动神经元传递的通路中可能存在缝隙连接或谷氨酸能兴奋性驱动。在 CO 存在的情况下，神经肌肉接头（NMJs）被阻断或对谷氨酸的敏感性降低2，并且它们在中枢神经系统内也可能被阻断（Bierbower，2010；Bierbower 和 Cooper，2010；另见 Badre 等, 2005).
多种神经调质在各类神经肌肉接头（NMJ）中的作用也易于进行研究（Cooper 和 Cooper，2009；Griffis et al.，2000；Southard et al.，2000；Strawn et al.，2000）。此外，神经调质还会对中枢神经系统（CNS）神经回路产生多种影响。有研究提出，5-HT 和章鱼胺能神经元可能在调节神经回路输出中起到“增益设定器”的作用（Ma et al.，1992；Schneider et al.，1996；Hörner et al.，1997；Edwards et al.，2002）。在全面理解神经调质对单个靶细胞的作用之前，仍需开展大量工作。鉴于不同的神经调质可能相互协同作用，对其混合效应的分析将是未来研究的方向之一（Djokaj et al.，2001）。此外，目前针对神经调质对完整通路（可调控特定行为的通路）影响的研究仍较少，尤其是在脊椎动物中。在此感觉-CNS-运动神经元功能单元制备模型中，可同时考察感觉输入和神经调质对运动神经元活动的影响（Kennedy et al.，1969）。
由于已有假说认为5-HT在调节小龙虾、龙虾和螃蟹的行为状态中起作用（Livingstone et al., 1980；Sneddon et al., 2000），研究人员已多次尝试测定其在腹神经索（VNC）、血淋巴以及龙虾离体神经节中的浓度（Livingstone et al., 1980；Harris-Warrick 和 Kravitz, 1984；Fadool et al., 1988）。然而，所记录的测量结果存在较大差异，难以建立能够解释行为效应的明确剂量-反应关系。
人们认为，将螯足举高并将尾部 tucked 在腹部下方的小龙虾表现出一种优势姿态（Livingstone et al., 1980）。然而，小龙虾腹部屈曲的状态似乎并非在成对个体中占据优势地位的小龙虾在社会互动过程中或维持优势等级地位时所表现出的姿态（Listerman et al., 2000）。处于从属地位的小龙虾在逃离对手时，甚至会将腹部蜷缩于身体下方。这种尾部蜷缩行为也被视为一种防御姿态（Listerman et al., 2000）。这些行为在野外和实验室环境中均已被广泛观察到（Bovbjerg, 1953, 1956；Bruski 和 Dunham, 1987；Li et al., 2000；Listerman et al., 2000）。有趣的是，在龙虾中观察到的行为姿态（Livingstone et al., 1980）与在澳大利亚小龙虾 Cherax destructor 中注射5-HT和章胺后的反应相反（McRae, 1996）。在澳大利亚小龙虾的浅层屈肌制备中，可能会观察到完全不同的反应。此外，由于小龙虾的优势地位通常与其体型相关，因此可以预期其存在一个高度可塑的响应系统，以快速适应变化的社会环境（Strawn et al., 2000）。无脊椎动物对神经调质响应的可塑性仍是当前有待深入研究的领域。
Wyttenbach、Johnson 和 Hoy（1999 年）制作了数字媒体和实验手册，涵盖了本报告中所述相同肌肉以及其他小龙虾标本的各种实验。这是学生实验的优秀资源。
致谢
由肯塔基大学生物学系、本科教育办公室及文理学院提供支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
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