使用螯虾后肠进行生理学实验：一项学生实验室练习

摘要

在本报告中，我们展示了可用于研究小龙虾后肠生物学的技术。我们演示了如何解剖小龙虾腹部，并研究其相关的解剖结构、生理特性以及活动的调控机制。通过使用力传感器来测量节律性蠕动活动及收缩强度。

摘要

本报告旨在介绍用于制备螯虾后肠的解剖技术，并演示如何使用力传感器进行生理记录，以监测收缩强度。此外，我们还展示了如何直观地监测蠕动活动，该方法可作为多种肽类、生物源性胺类和神经递质的生物测定手段。该实验体系适用于生理学教学实验，也适合向学生演示药理学概念。该制备方法已应用逾百年，至今仍是一个理想的模型，可用于研究蠕动节律的产生与调控机制，以及揭示其调节过程的内在机理。50多年前始于后肠的药理学检测和受体亚型分类研究，至今仍为相关科研提供重要贡献。这一稳定可靠的实验体系非常适用于生理学与药理学领域学生的教学培训。

方案

1. 引言

关于小龙虾后肠的最新全面综述来自 Barbara E. Musolf 博士的学位论文（2007年，美国佐治亚州亚特兰大市佐治亚州立大学），其研究重点主要集中在血清素能调节及其神经支配（Musolf 等，2009）。甲壳动物后肠最早由比较解剖学先驱 Alexandrowicz 在100多年前开展研究（Alexandrowicz，1909），他描述了其神经支配的各个方面。此后多年研究不断深入，陆续明确了肌肉层类型与结构特征，探讨了后肠在整个动物体渗透调节中的总体功能，并研究了多种化合物对后肠收缩性的调节控制（参见 Musolf，2007年的综述）。值得注意的是，后肠的肛门部分不仅负责排出粪便，还能从环境中吸收水分以实现渗透调节。根据动物的需求，该肠段可发生正向或逆向的蠕动。

Alexandrowicz（1909年）发现了支配甲壳类动物后肠的两个神经丛，即内神经丛和外神经丛，这两个神经丛后来被证明是鉴定和表征神经递质的丰富来源。20世纪50年代，Ernst Florey博士开始对螯虾后肠进行一系列药理学研究，证明乙酰胆碱及其相关化合物以及肾上腺素和去甲肾上腺素均可调节后肠收缩（Florey，1954）。Florey是被称为“抑制因子-I”（Factor-I）的抑制性物质的发现者，他研究了该物质对多种组织标本的作用，包括螯虾的胃肠道系统（Florey，1961）。后来证实，抑制因子-I即为γ-氨基丁酸（GABA）。因此，螯虾后肠在突触抑制的早期研究中发挥了重要作用。

在发现GABA之后，其他一些假定的神经递质也被证实与后肠神经丛相关，并能引发生理反应。这些神经递质包括多巴胺（Elekes et al. 1988；Elofsson et al. 1968）、直肠肽（proctolin，RYLPG-OH；Mercier et al. 1997）、两种 orcokinin 肽（NFDEIDRSGFGFN 和 AFDEIDRSGFGFN；Bungart et al. 1994；Dircksen et al. 2000）、orcomyotropin（FDAFTTGFamide；Dircksen et al. 2000）以及一种肌抑制肽（myosuppressin peptide；Mercier et al. 1997；最可能为 pQDLDHVFLRFamide，参见 Stemmler et al. 2007）。这些物质均可调节后肠的自发性收缩活动，除GABA外，其余均表现为兴奋性作用。后肠还对谷氨酸和红藻氨酸（quisqualate）产生反应（Jones, 1962；Wrong et al. 2003），但尚未有明确证据表明存在谷氨酸能神经支配。介导各类神经递质作用的细胞内信使在很大程度上仍未被研究，但已有证据表明cAMP参与了多巴胺增强收缩的作用（Knotz & Mercier, 1995）。

尽管甲壳动物的后肠在去神经后仍能自发收缩，但这类收缩通常较弱且无规律（Wales，1982；Winlow & Laverack，1972a）。节律性蠕动需要中枢神经系统协调的运动输出，这种输出似乎起源于最后一个腹神经节（Winlow & Laverack，1972a，b，c）。在螯虾中，运动输出通过第7^腹根传递至后肠，该神经根包含75条轴突，其胞体位于最后一个腹神经节内（Kondoh & Hisada，1986）。至少部分肽类物质似乎由起源于最后一个腹神经节的神经元供应至后肠神经丛（Dircksen 等，2000；Mercier 等，1991b；Siwicki & Bishop，1986），但多巴胺则由更靠前的神经节中的神经元提供（Mercier 等，1991a）。由于通过第7^腹根的运动输出是产生强而协调收缩所必需的，因此上述列出的某些或全部假定递质可能在某种程度上参与了蠕动过程。然而，它们各自的贡献程度尚不清楚。通过分别研究这些物质对环行肌和纵行肌的作用，或许可以获得一些认识（Mercier & Lee，2002）。

除了调控未消化食物的移动外，与甲壳动物后肠相关的神经丛似乎还具有与蜕皮相关的重要内分泌功能。蟹类Carcinus maenas的后肠含有内分泌细胞，可在蜕皮期（ecdysis）释放甲壳动物高血糖激素及其相关的前体肽（Webster et al. 2000），提示其在蜕皮过程中水分吸收和身体膨胀方面发挥作用。因此，甲壳动物的后肠参与了多种重要的生理过程。

本报告主要作为生理学课程中参与实验的高中高年级学生和本科生的教学工具。学生可通过本实验探讨昆虫后肠收缩与功能的意义及其潜在机制。实验将使用药理学试剂、神经递质和神经激素，并构建剂量-反应曲线，使学生掌握生理学和药理学数据的获取与解读方法。学生还将理解受体功能的基本概念，包括激动剂与拮抗剂的作用。此外，学生将学习如何以图形形式呈现数据，用于统计分析。

从螯虾后肠分离并记录其收缩活动非常简便。在离体标本中，肠道可轻易暴露于外源性物质。蠕动活动的变化可通过肉眼观察或使用力传感器进行监测，后者还可记录收缩的力量。由于该生物测定标本操作简单且结果可靠，螯虾后肠至今仍广泛用于研究多种科学问题，包括蠕动机制、运动输出和肌肉收缩的调控，以及受体功能。此外，后肠也适用于检测杀虫剂、杀甲壳类药物及污染物的作用机制。

2. 方法

2.1）材料

• 小龙虾
• 小龙虾生理盐水
• 解剖器械（粗剪刀和细剪刀、粗镊子和细镊子）
• 硅胶底培养皿
• 钢制解剖针
• 烧杯（用于盛放化学溶液）
• Parafilm膜（用于覆盖和混合溶液）

2.2）解剖

1. 将体长为 6-10 cm 的克氏原螯虾（Procambarus clarkii）置于冰上 5 至 10 分钟，以在开始解剖前麻醉动物。
2. 用一只手握住麻醉后的克氏原螯虾，位置在其螯足后方。迅速从眼窝处向头部中央沿两侧切割，随后将虾头切除（注意：标本血液干燥后会变得黏稠，因此操作完成后应及时清洗工具）。
   
   图 1：克氏原螯虾去头操作
3. 切除螯足和步足。
4. 切除左右尾鳍，仅保留中间尾鳍（尾肢）。
5. 在克氏原螯虾背侧，沿背甲左右两侧向腹面进行纵向切开。
   
   图 2：去除背甲
6. 在背甲背侧做横向切割，注意切口应较浅，以防损伤胃肠道（G.I.）。随后移除腹部背侧甲壳的下部。
7. 将已解剖的克氏原螯虾放入涂有硅胶的培养皿中。
8. 用大头针将克氏原螯虾固定在尾鳍尖端处。可根据需要在胃肠道两侧额外使用大头针将身体压紧固定。
9. 向培养皿中加入克氏原螯虾生理盐水，直至完全覆盖胃肠道。务必持续使用移液器向胃肠道滴加生理盐水以保持湿润。生理盐水为改良的 Van Harreveld 溶液（1936），其成分为：205 mM NaCl；5.3 mM KCl；13.5 mM CaCl₂·2H₂O；2.45 mM MgCl₂·6H₂O；5 mM HEPES，调节 pH 至 7.4。解剖完成的克氏原螯虾应如图 3 所示。
   
   图 3：胃肠道完整的解剖后克氏原螯虾

2.3）实验

2.3.1）动物体内的收缩反应

1. 准备好待测化合物的溶液，并使其温度与灌流任氏液（bathing saline）相同。可使用分别配制在螯虾任氏液中的5-羟色胺（100 nM、1 µM）、谷氨酸（1 µM）和多巴胺（1 µM）溶液作为初始待测物质。
2. 将解剖好的螯虾置于螯虾任氏液中静置约十分钟，使其适应解剖操作及任氏液暴露带来的刺激。此时，后肠应开始出现缓慢的蠕动性收缩。
3. 一旦收缩开始，记录三十秒内发生的收缩次数（注意记录收缩类型：例如蠕动型或痉挛型，以及任何蠕动波的传播方向）。
   表1：螯虾任氏液中的收缩情况
   

   收缩次数	收缩类型

4. 使用移液器吸除螯虾暴露腹腔内的任氏液，并将含有待测物质的任氏液直接施加于后肠表面。
5. 添加溶液后立即开始记录三十秒内发生的收缩次数，并记录收缩类型（例如蠕动型或痉挛型）。
   表2：暴露于化合物后的收缩情况
   

   待测化合物	浓度	收缩次数	收缩类型

6. 记录完待测物质的反应后，立即用正常的螯虾任氏液多次冲洗消化道。冲洗间隔约为每30秒一次，整个静置时间为5分钟。
7. 使用移液器将含有下一个待测化合物或上一种物质不同浓度的溶液直接施加于后肠表面。建议从较低浓度开始，逐步提高浓度进行测试。
8. 每次添加新的物质或新的浓度后，立即记录三十秒内发生的收缩次数，并记录收缩类型。

2.3.2）记录离体标本的收缩力

图 4：实验装置

1. 将换能器连接到桥式探头。
2. 将桥式探头连接到 PowerLab 26T。
3. 将 PowerLab 26T 连接到计算机的 USB 端口。
4. 通过点击桌面上的 labchart7 图标打开 LabChart7。
   • LabChart 欢迎中心窗口将弹出，将其关闭。
   • 点击“设置”（Setup）。
   • 点击“通道设置”（channel settings），将通道数量更改为 1（位于窗口左下角），然后点击“确定”（OK）。
   • 在图表左上角，将每秒周期数设置为约 2k，将电压（y 轴）设置为约 500 或 200 mV。
   • 点击图表右侧的通道 1，然后点击“输入放大器”（Input Amplifier）。确保勾选以下设置：单端输入（single-ended）、交流耦合（ac coupled）、反相（invert，根据需要反转信号）以及抗混叠（anti-alias）。
   • 点击“开始”以开始记录。
5. 取出发育组织，在胸部与腹部交界处切断消化道，然后小心地沿尾部尾节部分进行环形剪切。将消化道从解剖好的螯虾中取出，并放入 Sylgard 培养皿中。消化道背侧有一条血管，小心将其从消化道上剥离。向组织样本中加入新鲜的螯虾生理盐水。
6. 将力换能器放置在靠近解剖好的螯虾的夹具中。
7. 如图 5 所示，将力换能器钩住螯虾的胃肠道。
   
   图 5： 浸泡在生理盐水中的孤立螯虾后肠，连接至力换能器的钩上
8. 等待胃肠道开始收缩，然后点击 LabChart7 上的“开始”按钮。
9. 让程序运行约 20 秒，点击“停止”，并在图表文件上添加一条标注为“仅生理盐水”的注释。填写表 4。
   表 4：目标化合物作用下的收缩情况
   

   收缩次数	收缩幅度 (mV)

10. 加入目标测试化合物，并立即点击 LabChart7 上的“开始”按钮。
11. 让程序运行约 20 秒，点击“停止”，并在图表文件上直接添加注释，注明所加入的物质及其浓度。填写下表。
    表 5：_________ 化合物作用下的收缩情况
    

    收缩次数	收缩幅度 (mV)

12. 使用移液器以螯虾生理盐水冲洗组织样本。
13. 以类似方式加入其他物质或不同浓度的溶液，并立即点击 LabChart7 上的“开始”按钮。
14. 让程序运行约 20 秒，点击“停止”，并在图表文件上直接添加注释和标签，标明所用化合物及其浓度。

3. 数据分析

1. 根据实验 2.3.1，绘制每种溶液（生理盐水、5-羟色胺、谷氨酸）的收缩次数随时间变化的曲线图。解释任何趋势。
2. 根据实验 2.3.2，绘制每种溶液（生理盐水、5-羟色胺、谷氨酸）的收缩次数与收缩幅度（mV）的关系图。解释任何趋势。

3.1 ) 测量收缩的速率和力度

为了计算收缩频率，可以测量一次偏转开始到下一次偏转开始之间的时间，或者统计一至两分钟内的总偏转次数。然后可根据收缩发生的快慢，将数值表示为每分钟或每秒的收缩次数。

为了量化收缩力，可采用相对测量值来比较不同条件下的情况。在已保存的文件中，可使用标记“M”并将其移至基线处，然后移动光标至偏转波形的峰值，并记录屏幕右上角显示的差值（即从M点到峰值的变化量）。注意在测量变化值时需保持光标静止。随后将标记“M”移至下一个感兴趣的波形，重复上述测量步骤。

讨论

相关视频和文本中提供的细节描述了记录小龙虾后肠活动所需的关键步骤 原位 以及 体外本报告的一个目标是提高人们对这种制备方法在学生自主开展的实验教学实验室中潜力的认识，以帮助讲授生理学和药理学中的基本概念。

这些制备方法可用于研究多个实验问题，有助于更深入地理解后肠的生理功能。目前，尚不清楚调控蠕动波及其逆转的机制。对于整个胃肠道的高级调控机制也尚未完全阐明。高级中枢如何将其活动与直接控制胃肠道系统的自主神经输出相整合，仍是待探索的研究领域（Shuranova et al., 2006）。此外，甲壳动物后肠的渗透调节能力，以及在蜕皮和环境应激过程中渗透调节的功能，尚未被充分阐明。这一实验体系中仍有许多问题有待解答。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小龙虾（Procambarus clarkii），购自美国路易斯安那州拉塞尔县阿查法拉亚生物供应公司（Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA）。 标准小龙虾生理盐水：改良自Van Harreveld溶液（1936年）。（单位为 mM）205 NaCl；5.3 KCl；13.5 CaCl2·2H2O；2.45 MgCl2·6H2O；5 HEPES，调节pH至7.4。血清素、谷氨酸和多巴胺均用小龙虾生理盐水配制。所有化学试剂均购自Sigma化学公司（St. Louis, MO）。 解剖工具：精细#5镊子、精细剪刀、刀片夹持器、#26002-20昆虫针（均购自Fine Science Tools (USA), Inc.，地址：373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139）。 底部涂有Sylgard的培养皿 烧杯（用于盛放化学溶液） 电信号通过PowerLab 26T接口实时记录到计算机中（ADInstruments，美国科罗拉多斯普林斯）。我们使用ADInstruments公司提供的标准软件Chart或Scope。 桥式放大器模块（Bridge pod），用于连接力传感器（不同类型的力传感器需使用不同的Bridge pod）。 MLT0402（2克）力传感器为视频中所示的研究级传感器。MLT 0210/D（10 mg–25克）和MLT 500/A（0–500克）为教学级传感器（ADInstruments）。