在本报告中，我们展示了可用于研究小龙虾后肠生物学的技术。我们演示了如何解剖小龙虾腹部，并研究其相关的解剖结构、生理特性以及活动的调控机制。通过使用力传感器来测量节律性蠕动活动及收缩强度。
本文内容
摘要
摘要
本报告旨在介绍用于制备螯虾后肠的解剖技术，并演示如何使用力传感器进行生理记录，以监测收缩强度。此外，我们还展示了如何直观地监测蠕动活动，该方法可作为多种肽类、生物源性胺类和神经递质的生物测定手段。该实验体系适用于生理学教学实验，也适合向学生演示药理学概念。该制备方法已应用逾百年，至今仍是一个理想的模型，可用于研究蠕动节律的产生与调控机制，以及揭示其调节过程的内在机理。50多年前始于后肠的药理学检测和受体亚型分类研究，至今仍为相关科研提供重要贡献。这一稳定可靠的实验体系非常适用于生理学与药理学领域学生的教学培训。
方案
1. 引言
最近对 crayfish 后肠的全面综述来自 Barbara E. Musolf 博士的学位论文（2007，美国佐治亚州亚特兰大市，佐治亚州立大学），该研究主要关注5-羟色胺能调节与神经支配（Musolf 等，2009）。甲壳动物后肠最早由比较解剖学先驱Alexandrowicz在100多年前进行研究（Alexandrowicz，1909），他描述了后肠神经支配的各个方面。此后多年研究不断深入，明确了肌肉层类型与组织结构，探讨了后肠在整体动物渗透调节中的功能，并研究了多种化合物对后肠收缩性的调节控制（参见Musolf，2007年的综述）。值得注意的是，后肠的肛门部分不仅具有排出粪便的功能，还能从环境中吸收水分以实现渗透调节。根据动物的需求，该肠段可发生正向或逆向的蠕动。
Alexandrowicz（1909年）鉴定出两种支配甲壳类动物后肠的神经丛，即内神经丛和外神经丛，这两种神经丛后来被证明是鉴定和表征神经递质的丰富来源。20世纪50年代，Ernst Florey博士开始对螯虾后肠进行一系列药理学研究，证明乙酰胆碱及其相关化合物以及肾上腺素和去甲肾上腺素均可调节后肠收缩（Florey，1954）。Florey是被称为“抑制因子I（Factor-I）”的抑制性物质的发现者，他研究了该物质对多种组织标本的作用，包括螯虾的消化道系统（Florey，1961）。后来证实，抑制因子I即为γ-氨基丁酸（GABA）。因此，螯虾后肠在突触抑制的早期研究中发挥了重要作用。
在发现GABA之后，其他一些假定的神经递质也被证实与后肠神经丛相关，并能引发生理反应。这些神经递质包括多巴胺（Elekes et al. 1988；Elofsson et al. 1968）、促直肠肽（proctolin，RYLPG-OH；Mercier et al. 1997）、两种 orcokinin 肽（NFDEIDRSGFGFN 和 AFDEIDRSGFGFN；Bungart et al. 1994；Dircksen et al. 2000）、促肌收缩神经肽（orcomyotropin，FDAFTTGFamide；Dircksen et al. 2000）以及一种肌抑制肽（myosuppressin peptide；Mercier et al. 1997；最可能为 pQDLDHVFLRFamide，参见 Stemmler et al. 2007）。这些物质均可调节后肠的自发性收缩活动，除GABA外，其余均表现为兴奋性作用。后肠对谷氨酸和红藻氨酸（quisqualate）也有反应（Jones, 1962；Wrong et al. 2003），但尚未有明确证据表明存在谷氨酸能神经支配。介导这些不同神经递质作用的细胞内信使机制在很大程度上仍未被探索，但已有研究表明cAMP参与了多巴胺增强收缩的作用（Knotz & Mercier, 1995）。
尽管甲壳动物后肠在去神经后仍能自发收缩，但这类收缩通常较弱且无规律（Wales, 1982; Winlow） & Laverack，1972a）。节律性蠕动运动需要中枢神经系统发出协调的运动输出，该输出似乎起源于腹部最后一对神经节（Winlow）。 & Laverack, 1972a, b, c)。在小龙虾中，运动输出通过第7条神经传递至后肠th 腹部神经根，其中包含75条轴突，其胞体位于最后一对腹神经节内（Kondoh） & Hisada, 1986)。至少部分肽类似乎由源自最后一对腹神经节的神经元供应至后肠神经丛（Dircksen 等 2000；Mercier 等 1991b；Siwicki & Bishop, 1986），但多巴胺由更靠前的神经节中的神经元提供（Mercier 等 1991a)。由于通过7的运动输出th 腹部神经根对于产生大范围的协调性收缩是必需的，因此上述列出的某些或全部假定递质可能在某种程度上参与了蠕动过程。然而，它们各自的贡献尚不明确。通过分别研究这些递质对环形肌和纵行肌的作用，或许可以获得一些认识（Mercier & Lee, 2002)
除了调控未消化食物的移动外，与甲壳动物后肠相关的神经丛似乎还具有与蜕皮相关的重要内分泌功能。蟹类Carcinus maenas的后肠含有内分泌细胞，可在蜕皮期（ecdysis）释放甲壳动物高血糖激素及其相关的前体肽（Webster et al. 2000），提示其在蜕皮过程中参与水分吸收和组织膨胀。因此，甲壳动物的后肠参与了多种重要的生理过程。
本报告主要作为生理学课程中参与实验的高中高年级学生和本科生的教学工具。学生可通过本实验探讨昆虫后肠收缩及其功能的意义及潜在机制。实验将使用药理学试剂、神经递质和神经激素，并绘制剂量-反应曲线，使学生掌握生理学和药理学数据的获取与解读方法。学生还可由此获得关于受体功能（包括激动剂与拮抗剂）的基本理解。此外，学生将学习如何以图形形式呈现数据，以便进行统计分析。
从螯虾后肠分离并记录其收缩活动非常简便。在离体标本中，肠道易于暴露于外源性物质。节律性蠕动活动的变化可通过肉眼观察或使用测力换能器进行监测，后者还可记录收缩力的大小。由于该生物测定标本操作简单且结果可靠，螯虾后肠至今仍广泛用于研究蠕动机制、运动输出调节、肌肉收缩以及受体功能等多个科学问题。此外，后肠也适用于检测杀虫剂、杀甲壳动物剂及污染物的作用机制。
2. 方法
2.1）材料
- 小龙虾
- 小龙虾生理盐水
- 解剖器械（粗剪刀和细剪刀、粗镊子和细镊子）
- 硅胶底培养皿
- 不锈钢解剖针
- 烧杯（用于盛放化学溶液）
- 封口膜（用于覆盖和混合溶液）
2.2）解剖
- 将体长为 6-10 cm 的克氏原螯虾（Procambarus clarkii）置于冰上 5 至 10 分钟，以麻醉动物，随后开始解剖。
- 用一只手握住麻醉后的克氏原螯虾，位置位于螯足后方。迅速从眼窝处向头部中央沿两侧剪开，然后将头切除（注意：标本血液干燥后会变黏，操作完成后应及时清洗工具）。
图 1：克氏原螯虾去头操作 - 切除螯足和步足。
- 切除左右尾鳍，仅保留中央尾鳍（尾附肢）。
- 在克氏原螯虾背侧，沿背甲左右两侧向腹侧剪开。
图 2：去除背甲 - 在背甲背侧做横向剪切，注意切口应浅，以防损伤胃肠道（G.I.）。随后移除腹部背侧甲壳的下部。
- 将已解剖的克氏原螯虾放入涂有 Sylgard 的培养皿中。
- 用大头针将克氏原螯虾固定在尾鳍尖端处。根据需要，可在胃肠道两侧使用更多大头针将身体固定。
- 向培养皿中加入克氏原螯虾生理盐水，使盐水覆盖胃肠道。务必持续使用移液器向胃肠道滴加生理盐水。生理盐水为改良的 Van Harreveld 溶液（1936），其成分为：205 mM NaCl；5.3 mM KCl；13.5 mM CaCl2·2H2O；2.45 mM MgCl2·6H2O；5 mM HEPES，并调节至 pH 7.4。解剖后的克氏原螯虾应如图 3 所示。
图 3：胃肠道完整的解剖克氏原螯虾
2.3）实验
2.3.1) 动物体内的收缩反应
- 准备好待测化合物的溶液，并使其温度与灌流任氏液相同。可使用分别配制的5-羟色胺（100 nM，1 µM）、谷氨酸（1 µM）和多巴胺（1 µM）溶液（溶于螯虾任氏液）作为初始待测物质。
- 将解剖好的螯虾置于螯虾任氏液中静置约10分钟，使其适应解剖操作及任氏液暴露带来的刺激。此时后肠应开始出现缓慢的蠕动性收缩。
- 一旦收缩开始，记录30秒内发生的收缩次数（注意记录收缩类型：例如蠕动型或痉挛型，以及任何蠕动波的传播方向）。
表1：螯虾任氏液中的收缩情况
收缩次数 收缩类型 - 使用移液器吸除螯虾暴露腹腔内的任氏液，直接将含有待测物质的任氏液滴加至后肠表面。
- 添加溶液后立即开始记录，统计30秒内发生的收缩次数，并记录收缩类型（例如蠕动型或痉挛型）。
表2：暴露于不同化合物后的收缩情况
待测化合物 浓度 收缩次数 收缩类型 - 记录完待测物质的反应后，立即用正常的螯虾任氏液对胃肠道进行多次冲洗。冲洗间隔约为30秒一次，持续静置5分钟。
- 使用移液器将下一种待测化合物溶液或前一种物质的不同浓度溶液直接施加到后肠表面。建议从较低浓度开始，逐步提高浓度。
- 每次添加新的物质或新的浓度后，立即记录30秒内的收缩次数，并注明收缩类型。
2.3.2）记录离体标本的收缩力
图 4：装置
- 将换能器连接到桥式探头。
- 将桥式探头连接到 PowerLab 26T。
- 将 PowerLab 26T 连接到计算机的 USB 接口。
- 通过单击桌面上的 labchart7 图标打开 LabChart7。
- LabChart 欢迎中心窗口将弹出，将其关闭。
- 单击“Setup”（设置）。
- 单击“Channel Settings”（通道设置），将通道数更改为 1（位于窗口左下角），然后点击“OK”。
- 在图表左上角，将每秒周期数设置为约 2k，将电压（y 轴）设置为约 500 或 200 mV。
- 单击图表右侧的“Channel 1”（通道 1），然后单击“Input Amplifier”（输入放大器）。确保选中以下设置：单端输入（single-ended）、交流耦合（ac coupled）、反相（invert，根据需要反转信号）以及抗混叠（anti-alias）。
- 开始记录时，点击“Start”（开始）。
- 取出标本，在胸部与腹部交界处切断消化道。然后小心地围绕尾部尾节部分进行切割。将消化道从解剖好的螯虾体内取出，并放入 Sylgard 培养皿中。消化道背侧有一条血管，需小心将其从消化道上剥离。向标本中加入新鲜的螯虾生理盐水。
- 将力换能器安装在靠近解剖标本的夹具上。
- 如图 5 所示，将力换能器的钩子连接到螯虾消化道上。
图 5： 浸于生理盐水中的离体螯虾后肠，连接至力换能器的钩子 - 等待消化道开始收缩，然后在 LabChart7 上点击“Start”（开始）。
- 运行程序约 20 秒后，点击“Stop”（停止），并在图表文件中添加注释，标注为“仅生理盐水”。填写表 4。
表 4：含目标化合物时的收缩情况
收缩次数 收缩幅度（mV） - 加入待测的目标化合物，并立即在 LabChart7 上点击“Start”（开始）。
- 运行程序约 20 秒后，点击“Stop”（停止），并在图表文件中直接添加注释，注明所加物质及其浓度。填写下表。
表 5：含_________化合物时的收缩情况
收缩次数 收缩幅度（mV） - 使用移液器以螯虾生理盐水冲洗标本。
- 以类似方式加入其他物质或不同浓度的溶液，并立即在 LabChart7 上点击“Start”（开始）。
- 运行程序约 20 秒后，点击“Stop”（停止），并在图表文件中直接添加注释和标签，标明所用化合物及其浓度。
3. 数据分析
- 根据实验 2.3.1，绘制每种溶液（生理盐水、5-羟色胺、谷氨酸）的收缩次数随时间变化的曲线图。解释任何趋势。
- 根据实验 2.3.2，绘制每种溶液（生理盐水、5-羟色胺、谷氨酸）的收缩次数与收缩幅度（mV）的关系图。解释任何趋势。
3.1 ) 测定收缩的速率和力度
可通过测量一次偏转开始到下一次偏转开始的时间，或统计一至两分钟内的总偏转次数，来计算收缩频率。然后可根据收缩发生的快慢，将数值表示为每分钟或每秒的收缩次数。
为了量化收缩力，可采用相对测量值来比较不同条件下的情况。在已保存的文件中，可使用标记“M”并将其移至基线处，然后使用光标移至偏转波形的峰值，并记录屏幕右上角显示的差值（即从M到峰值的差值）。注意在测量变化值时需保持光标静止不动。随后将标记“M”移至下一个感兴趣的波形，重复上述测量步骤。
讨论
相关视频和文本中提供的细节描述了记录小龙虾后肠活动所需的关键步骤 原位 以及 体外本报告的一个目标是提高人们对这种制备方法在学生自主开展的实验教学实验室中潜力的认识，以帮助讲授生理学和药理学中的基本概念。
这些制备方法可用于研究多个实验问题，有助于更深入地理解后肠的生理功能。目前，尚不清楚调控蠕动波及其逆转的机制。对于整个胃肠道的高级调控机制也尚未完全阐明。高级中枢如何将其活动与直接控制胃肠道系统的自主神经输出相整合，仍是待探索的研究领域（Shuranova et al., 2006）。此外，甲壳动物后肠的渗透调节能力，以及在蜕皮和环境应激过程中渗透调节的功能，尚未被充分阐明。这一实验体系中仍有许多问题有待解答。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
由肯塔基大学生物学系、本科教育办公室及文理学院提供支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
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参考文献
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