通过胚胎体冰冻切片分析多能干细胞

摘要

多能干细胞在悬浮培养中可分化形成类胚体（EBs）。本文展示了如何获得高质量的类胚体冷冻切片，这些切片可用于研究胚胎发生过程中的细胞和分子特征，同时保持其作为细胞聚集体的原有结构。

摘要

胚胎干细胞（ES细胞）是来源于囊胚期早期哺乳动物胚胎内细胞团的多能细胞¹。ES细胞分化过程中的一个关键阶段是类胚体（EBs）聚集体的形成^{2, 3}。当ES细胞在非黏附培养板中培养时，可自发聚集形成EB。三维结构的EB可模拟早期哺乳动物胚胎发生的多个方面，并分化为三个胚层：外胚层、中胚层和内胚层⁴。

免疫荧光和原位杂交是广泛用于检测组织切片中细胞内目标蛋白和 mRNA 的常用技术^{5, 6, 7}。本文介绍一种简便的方法，用于制备高质量的类胚体（embryoid bodies, EB）冷冻切片。该方法依赖于将 EB 在 OCT 包埋剂中进行空间定向包埋，随后进行冷冻切片。所得切片可适用于多种分析程序，以表征含有特定蛋白、RNA 或 DNA 的细胞群体。在此意义上，制备 EB 冷冻切片（10μm）是组织学染色分析（如苏木精-伊红染色、DAPI）、免疫荧光（如 Oct4、nestin）或原位杂交的关键工具。该技术还有助于理解与类胚体三维球形结构维持相关的胚胎发育过程。

方案

1. 固定与冷冻保存

将多能干细胞培养在经丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）上，并在添加20%敲除血清替代物（KSR）和8 ng/mL成纤维细胞生长因子（FGF-2）的DMEM/F12培养基中维持培养。为了诱导拟胚体（EB）形成，将H9细胞转移至非黏附培养皿中，在添加15% KSR的DMEM/F12培养基中培养7天⁸。

注意（!）：该技术可用于来源于任何胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的拟胚体。

1. 用移液器从培养皿中收集拟胚体（EBs）。
2. 将拟胚体转移至15 mL锥形管中，静置直至材料沉降至管底。
3. 移除培养基，并用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液在室温下固定拟胚体30分钟。
   注意（!）：对于 原位 为避免因使用PFA而导致与抗体发生交联反应，应进行杂交抗原修复。^6,7.
4. 去除PFA溶液，用PBS洗涤5分钟。
5. EBs 应置于 PBS 缓冲的蔗糖溶液（依次为 10%、20% 和 30%）中进行梯度脱水，温度为 25–28°C，每种浓度溶液每隔 30 分钟更换一次。处理后的样品可保存在 30% 蔗糖溶液中，置于 4°C，直至进行 OCT 包埋。

2. 组织包埋、引导与冷冻

讨论

本文所述方法提供了一种简单易行的方案，用于制备经PFA固定的类胚体薄冰冻切片，适用于免疫荧光和原位杂交检测。所得冰冻切片可在保持类胚体聚集体结构和组织形态的前提下，用于研究人类胚胎干细胞分化的细胞与分子特征。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
D (+) 蔗糖	试剂	Vetec	228
多聚甲醛	试剂	Rieden-de Haën	16005
PBS 溶液	试剂	LGC Biotecnology	13-30259.05
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐	试剂	Sigma-Aldrich	P2636	200mg/mL 水溶液
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	试剂	Sakura Finetek	P2636
蔗糖溶液	试剂			10% 蔗糖溶液（PBS 配制，w/v）
蔗糖溶液	试剂			20% 蔗糖溶液（PBS 配制，w/v）
蔗糖溶液	试剂			30% 蔗糖溶液（PBS 配制，w/v）
锥形管	工具	Techno Plastic Products	91015	15 mL 锥形管
平板摇床	工具	Biomixer
冷冻切片机	工具	Leica Microsystems	CM 1850
OCT 平台模具	工具			塑料模具平台