多能干细胞在悬浮培养中可分化形成类胚体（EBs）。本文展示了如何获得高质量的类胚体冷冻切片，这些切片可用于研究胚胎发生过程中的细胞和分子特征，同时保持其作为细胞聚集体的原有结构。
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本文内容
摘要
摘要
胚胎干细胞（ES细胞）是来源于囊胚期早期哺乳动物胚胎内细胞团的多能细胞1。ES细胞分化过程中的一个关键阶段是类胚体（EBs）聚集体的形成2, 3。当ES细胞在非黏附培养板中培养时，可自发聚集形成EB。三维结构的EB可模拟早期哺乳动物胚胎发生的多个方面，并分化为三个胚层：外胚层、中胚层和内胚层4。
免疫荧光和原位杂交是广泛用于检测组织切片中细胞内目标蛋白和 mRNA 的常用技术5, 6, 7。本文介绍一种简便的方法，用于制备高质量的类胚体（embryoid bodies, EB）冷冻切片。该方法依赖于将 EB 在 OCT 包埋剂中进行空间定向包埋，随后进行冷冻切片。所得切片可适用于多种分析程序，以表征含有特定蛋白、RNA 或 DNA 的细胞群体。在此意义上，制备 EB 冷冻切片（10μm）是组织学染色分析（如苏木精-伊红染色、DAPI）、免疫荧光（如 Oct4、nestin）或原位杂交的关键工具。该技术还有助于理解与类胚体三维球形结构维持相关的胚胎发育过程。
方案
1. 固定与冷冻保存
将多能干细胞培养在经丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）上，并在添加20%敲除血清替代物（KSR）和8 ng/mL成纤维细胞生长因子（FGF-2）的DMEM/F12培养基中维持培养。为了诱导拟胚体（EB）形成，将H9细胞转移至非黏附培养皿中，在添加15% KSR的DMEM/F12培养基中培养7天8。
注意（!）：该技术可用于来源于任何胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的拟胚体。
- 用移液器从培养皿中收集拟胚体（EBs）。
- 将拟胚体转移至15 mL锥形管中，静置直至材料沉降至管底。
- 移除培养基，并用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液在室温下固定拟胚体30分钟。
注意（!）：对于 原位 为避免因使用PFA而导致与抗体发生交联反应，应进行杂交抗原修复。6,7. - 去除PFA溶液，用PBS洗涤5分钟。
- EBs 应置于 PBS 缓冲的蔗糖溶液（依次为 10%、20% 和 30%）中进行梯度脱水，温度为 25–28°C，每种浓度溶液每隔 30 分钟更换一次。处理后的样品可保存在 30% 蔗糖溶液中，置于 4°C，直至进行 OCT 包埋。
2. 组织包埋、引导与冷冻
- 小心从离心管中收集胚胎体（EBs），尽可能排出蔗糖溶液。
注意 (!)：在收集胚胎体（EBs）前，务必用蔗糖溶液润湿移液枪头的内壁。此步骤可防止胚胎体粘附在枪头上。 - 将胚胎体（EBs）放入模具中，并用滤纸吸除残留的蔗糖溶液。
注意 (!)：放置胚胎体（EBs）时切勿过量填充模具，以免发生重叠。 - 缓慢向模具中加入OCT包埋剂，注意避免重新悬浮胚胎体（EBs）。随后，将所有胚胎体（EBs）调整至模具中央，并用移液枪去除气泡。
- 轻轻振荡15分钟。
- 用粉碎的干冰包围模具，以冻结样品。OCT应完全冻结。此时，样本块可在-70°C下保存，至少一年。
3. 冷冻切片技术
- 从 -70°C 取出冷冻组织块，置于已预冷至 -18 至 -21 °C 的冷冻切片机中。
注意 (!)：超出此温度范围可能导致切片卷曲、融化或开裂等问题。 - 将 OCT 包埋块从模具中取出，并通过添加更多 OCT 将其固定于冷冻切片机的样品台上。
- 正确放置组织块的方向并使其与刀刃边缘平行至关重要。
注意 (!)：由于胚胎体（EBs）比其他组织样本更小，此步骤对最大限度减少样本损失极为重要。 - 应先对 OCT 包埋块进行表层切削，直至获得平整的切面。随后切取组织样本的薄片（10 μm），并转移至预先涂有 200 mg/mL 多聚-L-赖氨酸（每张载玻片 10 μL）的玻璃载片上 9,10。
注意 (!)：为避免切片撕裂，请仔细检查刀片是否有损伤。 - 所有切片应在室温下空气干燥 1 小时，之后可立即使用或于 -70°C 保存至使用前。
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讨论
本文所述方法提供了一种简单易行的方案，用于制备经PFA固定的类胚体薄冰冻切片，适用于免疫荧光和原位杂交检测。所得冰冻切片可在保持类胚体聚集体结构和组织形态的前提下，用于研究人类胚胎干细胞分化的细胞与分子特征。
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致谢
本工作由里约热内卢州研究支持基金会（FAPERJ）、国家科学技术发展委员会（CNPq）和国家科学与技术研究所（INCTC）提供资助。我们感谢 Bruna S. Paulsen 和 Aline M. Fernandes 提供的 EB 图像。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| D (+) 蔗糖 | 试剂 | Vetec | 228 | |
| 多聚甲醛 | 试剂 | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS 溶液 | 试剂 | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| 聚-L-赖氨酸氢溴酸盐 | 试剂 | Sigma-Aldrich | P2636 | 200mg/mL 水溶液 |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | 试剂 | Sakura Finetek | P2636 | |
| 蔗糖溶液 | 试剂 | 10% 蔗糖溶液（PBS 配制，w/v） | ||
| 蔗糖溶液 | 试剂 | 20% 蔗糖溶液（PBS 配制，w/v） | ||
| 蔗糖溶液 | 试剂 | 30% 蔗糖溶液（PBS 配制，w/v） | ||
| 锥形管 | 工具 | Techno Plastic Products | 91015 | 15 mL 锥形管 |
| 平板摇床 | 工具 | Biomixer | ||
| 冷冻切片机 | 工具 | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| OCT 平台模具 | 工具 | 塑料模具平台 |
参考文献
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
- Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, 88-95 (2000).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).
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- Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Cells. 24, 76-82 (2007).
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- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).
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