记录人T淋巴细胞中钙释放激活钙（CRAC）电流的全细胞电生理技术

摘要

我们提供了一种用于记录外周血单个核细胞来源的人T淋巴细胞中钙释放激活钙（CRAC）电流的全细胞膜片钳技术的逐步实验方案。

摘要

在T淋巴细胞中，细胞内Ca²⁺储存库的Ca²⁺耗竭会激活质膜上的Ca²⁺通道，这类通道被称为钙库操纵性钙（CRAC）通道。CRAC通道在调控T细胞增殖和基因表达中发挥重要作用。T细胞中CRAC通道功能异常与严重联合免疫缺陷病及自身免疫性疾病密切相关^{1, 2}。研究人类T细胞中CRAC通道的功能，可能揭示调控正常免疫应答的新分子机制，并阐明相关人类疾病的病因。膜电流的电生理记录是评估通道功能特性及其调控机制最准确的方法。对Jurkat T细胞（一种人类白血病T细胞系）中CRAC通道电流的电生理记录最早于20多年前完成³，然而在正常人T细胞中记录CRAC电流仍是一项具有挑战性的任务。记录正常T细胞中CRAC通道电流的困难在于，来源于血液的T淋巴细胞体积远小于Jurkat T细胞，因此内源性的全细胞CRAC电流幅值非常低。本文中，我们提供了一种常规使用的分步操作流程，用于记录从健康志愿者外周血中分离的静息人T细胞中经CRAC通道介导的Ca²⁺或Na⁺电流。本方法借鉴了用于记录Jurkat T细胞及活化人T细胞中CRAC电流的已有实验流程^4-8。

方案

1. 静息人T淋巴细胞的制备

1. 使用 RosetteSep 人 T 细胞富集试剂和 RosetteSep 密度介质，根据制造商说明书从人血液样本中纯化 T 细胞。所得细胞群体应包含 95% CD3⁺ 静息 T 细胞。我们依据加州大学戴维斯分校机构审查委员会批准的方案，从健康志愿者外周血样本中纯化人 T 淋巴细胞。
2. 分离后，将静息 T 细胞重悬于细胞培养基中，细胞密度为 0.5 x 10⁶ 细胞/mL，培养基成分为含谷氨酰胺和 HEPES 的 RPMI-1640 培养基，并添加 10% 胎牛血清、2% GlutaMAX-I、1% RPMI 1640 维生素溶液、1% RPMI 1640 氨基酸溶液、1% 丙酮酸钠和 0.03% β-巯基乙醇。
3. 将细胞悬液置于细胞培养瓶中，在 37°C、含 5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育，实验前最多可维持 24 小时。

2. 记录室的制备

1. 制备记录室所需材料如下：a) 硅胶O形圈，b) 经70%乙醇和蒸馏H₂O清洗的圆形25 mm盖玻片，c) 按照生产商说明配制的混合Sylgard184，以及d) 两个60 × 15 mm的培养皿。
2. 将约0.5 mL混合Sylgard184加入一个60 × 15 mm培养皿中。
3. 使用镊子将O形圈的底部浸入Sylgard184中。
4. 将O形圈置于洁净表面（如另一个培养皿）上，去除其边缘多余的Sylgard184。
5. 将O形圈放置在盖玻片上并压紧。
6. 通过在85°C下加热40–60分钟或直至Sylgard184完全聚合，使其固化。
7. 将记录室存放于无尘容器中。

3. 制备膜片钳电极

1. 实验当天，使用玻璃毛细管和拉管仪拉制尖端直径约为 2-μm 的移液管。我们采用带细丝的硼硅酸盐玻璃管（外径：1.5 mm，内径：1.10 mm）。将移液管存放于无尘环境中。
2. 根据标准操作流程⁹，使用Sylgard184或HIPEC R6101半导体保护涂层对移液管尖端进行包被。
3. 实验前轻轻进行火焰抛光处理。

4. 膜片钳装置准备

1. 在控制膜片钳放大器的软件中配置并保存用于形成千兆欧封接的宏。我们使用由 Windows XP 和 Pulse 软件支持的 EPC-10 放大器进行数据采集。我们根据 EPC-10 手册设置"建立"、"细胞贴附"和"全细胞"宏，并将其用于所有实验。
2. 按照表1列出的成分配制浴液和移液管溶液，并在实验前将其储存于 4° C 长达1周。

化学试剂	灌流液（mM）			电极内液（mM）
	# 1	# 2	# 3
CH3SO3Na	130	110	125	-
NaCl	2	4	5	-
Ca(OH)2	-	20	-	-
MgCl2	3	1	-	5
MgSO4	-	-	-	2
HEPES	10	10	10	15
HEDTA	-		10	-
EDTA	-	-	1	-
Cs-aspartate	-	-	-	125
BAPTA	-	-	-	12
葡萄糖	10	10	10	-

表1. 全细胞CARC电流记录用溶液。

所有化学品均购自 Sigma-Aldrich，St. Louis, MO。

3. 测定膜片钳电极液与每种灌流液之间的液接电位（LJ）¹⁰。使用数据采集软件将LJ值保存在适当位置。例如，在Pulse程序中，将LJ值输入“放大器”窗口中的“LJ”控制项。
4. 在实验开始前，按照图1所示，在数据采集软件的适当位置配置并保存刺激方案。在Pulse程序中，我们在“脉冲生成”窗口中设置采集协议。
   
   图1. 刺激方案。 每0.2 - 2秒（5 - 0.5 Hz）施加一次持续50毫秒的电压斜坡，从-120 mV升至+100 mV。斜坡之间的钳制电位（V_h）维持在+30 mV。

5. 将细胞固定在显微镜载物台上

1. 用多聚赖氨酸（poly-_L-lysine）包被记录室约 20 分钟，然后用 H₂O 洗涤，再用 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）洗涤，之后接种细胞。
2. 将含有 0.2–0.5 × 10⁶ 个细胞的 500 μL 细胞悬液接种至记录室中，并在 37°C 下孵育 20 分钟。
3. 将带有贴壁细胞的记录室固定于记录室支架中。我们使用定制的记录室支架，其底部支撑盖玻片的下方，而上部则轻轻压住盖玻片的上方。
4. 将记录室支架置于倒置显微镜的载物台上。
5. 在透射光下对细胞进行调焦。我们使用 40X 油浸物镜。
6. 将 Ag/AgCl 参比电极插入浴液中。
7. 校准多通道重力驱动灌流系统。进液管的尖端应以 45° 角靠近视野区域放置于盖玻片附近。
8. 将吸液管置于进液管尖端的对侧位置。
9. 用磷酸盐缓冲液（PBS）或 HBSS 对记录室进行灌流，以洗去细胞培养基及未牢固贴附的细胞。

6. CRAC 通道电流记录

1. 找到一个牢固贴附在盖玻片上的细胞。我们通常选择大小适中、呈圆形且表面光滑的细胞。
2. 用含钙溶液灌注记录室²⁺无镁，3 mM Mg²⁺含浴液 #1（表 1），其中含有 0.5-1 μM 使用毒胡萝卜素（thapsigargin）处理 8-10 分钟，以阻断 SERCA 泵。此步骤旨在形成吉欧密封（gigaseal）前耗尽细胞内钙库。
3. 使用 Eppendorf 微量移液器和 P-20 移液枪，将电极内液（表 1）注入记录电极中，并将记录电极插入放大器头部的电极夹持器内。Ca²⁺ 螯合剂BAPTA被加入到移液管溶液中，以被动耗竭钙库并降低Ca²⁺依赖性CRAC通道失活
4. 施加少量正压（约3英寸水柱）₂O）在进入浴液之前，使用定制的压力-吸力装置连接加压空气和真空管路，以在膜片钳电极内产生正压或负压。
5. 在显微镜下通过视觉控制将记录电极移入浴液中。在“示波器”窗口中，应观察到有电流流经电极。此时，预设宏程序施加的小幅度电压脉冲（测试脉冲）应引起电流幅度的阶跃式变化。由此可测定电极电阻值。本实验所用电极的电阻通常为5–6 MΩ。
6. 校正移液管与参比电极之间产生的“零点”电位。
7. 在显微镜的视觉控制下，将移液器尖端靠近细胞，直至接触细胞膜。
8. 施加负压（20–40 英寸 H₂O）₂O）置于膜片移液管内。
9. 在“示波器”窗口中监测千兆欧姆封接的形成。您将观察到由测试脉冲引起的电流幅度减小，同时移液管电阻值上升至 >5 GΩ。通常在几秒内形成吉欧姆封接，但可能需要1-2分钟才能获得稳定的吉欧姆封接。
10. 补偿移液器电容（“C-Fast”）。
11. 使用20 ml注射器施加额外负压以击破膜片。
12. 将钳制电位设置为 +30 mV。正的钳制电位有助于防止钙依赖性的CRAC通道失活。
13. 补偿细胞的膜电容（“C-slow”）；保存或记录C-slow的数值。
14. 检查接入电阻“R”的数值_s。在我们的实验中，R_s 通常为 7-20 MΩ。
15. 以0.5 Hz的频率开始施加一系列电压斜坡（图1）至Ca²⁺不含 3 mM Mg²⁺含浴液 #1。在此溶液中，由于CRAC通道对Mg的通透性较差，CRAC电流相较于“漏”电流可忽略不计²⁺保存并将在灌流液#1中记录的当前轨迹用于后续分析，作为“漏”电流。在-100 mV时，“漏”电流的绝对幅值应小于或等于5 pA。若细胞“漏电”，则终止实验，更换新的膜片钳电极和新的细胞重新开始。
16. 为了记录 Ca²⁺ 通过CRAC通道的电流（I_Ca-CRAC), 替换 Ca²⁺无镁 3 mM Mg²⁺含20 mM Ca的浴液#1²⁺-通过切换灌流阀，更换为含浴液#2（表1），以实现Ca²⁺ 通过CRAC通道流动并产生内向电流。在“示波器”窗口中，您将观察到内向整流I的形成过程。_Ca-CRAC （图2）。由于Ca，在负电压下的电流幅度将在约1分钟内持续增加²⁺依赖性CRAC电流增强
17. 以电压梯度将刺激频率增加至 5 Hz，这是记录瞬时 Na⁺ 通过CRAC通道的电流
18. 更换 20 mM Ca²⁺含 Na 的浴液 #2⁺-通过切换灌流阀，更换为无双价阳离子溶液 #3（表 1）。在“示波器”窗口中，您将观察到幅值较大的瞬时内向整流 Na⁺ 通过CRAC通道的电流（I_Na-CRAC；图2）。
19. 可加入 20 mM Ca²⁺含浴液 #2，含 1-5 μM La³⁺ 实验结束时记录“漏电流”。然而，我们发现这种方法并不实用，因为“漏电流”会随时间变化，实验结束时可能变大或变小。我们更倾向于采用在 Ca 记录的电流²⁺不含 3 mM Mg²⁺实验开始时，将含浴液 #1 的电流作为“漏电流”进行记录。
20. 保存记录的电流轨迹，以供进一步分析。

7. 数据分析

1. 将保存的电流记录导入分析软件。我们使用 Pulse 程序进行分析。
2. 测量电压斜坡起始和结束时的电流幅度。我们通常在 Pulse 程序的“示波器”窗口中使用成对光标，测量 -100 mV 和 +100 mV 时的电流幅度。
3. 将电流幅度值导出至图形处理软件，用于进一步分析和图形呈现。我们使用 Origin 科学绘图与数据分析软件（版本 7）。

8. 代表性结果

图 2. 静息人 T 细胞中的 CRAC 电流。 （A），在全细胞电压钳制模式下于 -100 mV（实心圆）和 +100 mV（空心圆）记录的 CRAC 电流的时间过程。在形成吉欧封接（gigaseal）之前，细胞在含 3 mM Mg²⁺ 的无 Ca²⁺ 浴液 #1 中预孵育约 10 分钟，该溶液含有 0.5 μM 毒胡萝卜素（thapsigargin）。破膜后，依次施加以下浴液：含 3 mM Mg²⁺ 的无 Ca²⁺ 浴液 #1（0 Ca + 3 Mg），随后为含 20 mM Ca²⁺ 的浴液 #2（20 Ca），接着为无二价阳离子的浴液 #3（DVF），最后再回到浴液 #2（20 Ca）。细胞受到如图 1 所示的一系列电压斜坡刺激。在浴液 #3（DVF）中，斜坡频率为 5 Hz，而在所有其他溶液中为 0.5 Hz。注意在施加含 20 mM Ca²⁺ 的浴液 #2 后 I_Ca-CRAC 的缓慢发展，以及在 DVF 浴液 #3 中 I_Na-CRAC 的快速瞬时发展。（B），在含 3 mM Mg²⁺ 的无 Ca²⁺ 浴液 #1（“漏电流”）、含 20 mM Ca²⁺ 的浴液 #2（20 Ca）以及浴液 #3（DVF）中电压斜坡期间记录的代表性电流轨迹。（C, D），通过从含 20 mM Ca²⁺ 的浴液 #2（20 Ca）和浴液 #3（DVF）中记录的电压斜坡电流中减去“漏电流”所获得的 I_Ca-CRAC（C）和 I_Na-CRAC（D）的电流-电压关系，如图（B）所示。

讨论

在静息人T细胞中进行CRAC电流的电生理学研究是一项具有挑战性的任务，因为这些细胞的内源性CRAC电流幅值较小，其原因是细胞尺寸小（静息人T细胞的直径范围为5-8 μm）。本文中，我们提供了一种逐步操作流程，用于可靠地记录从外周血单个核细胞中分离出的静息人T淋巴细胞中的CRAC电流。该技术使我们能够研究静息T细胞中CRAC通道的生理特性及功能表达，从而更深入地理解正常与病理状态下免疫细胞反应的本质。利用本实验方案，不仅可以检测静息人T细胞中的CRAC电流，还可用于其他免疫细胞，如活化人T细胞、单核细胞和巨噬细胞中的CRAC电流测量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人T细胞富集鸡尾酒试剂 RosetteSep	Stem Cell Technologies	15061
RosetteSep 密度介质	Stem Cell Technologies	15705
含谷氨酰胺/HEPES的RPMI 1640培养基	Fisher Scientific	SH3025501
胎牛血清	Omega Scientific	FB-01
GlutaMAX-I（100倍溶液）	Invitrogen	35050
RPMI 1640 维生素溶液（100倍）	Sigma-Aldrich	7256
1640 氨基酸溶液（50倍）	Sigma-Aldrich	R7131
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	S8636
β-巯基–乙醇	Sigma-Aldrich	M7522
三磷酸肌醇	Sigma-Aldrich	19766
BAPTA	Sigma-Aldrich	A4926
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P2636
氯化镧	Sigma-Aldrich	262072
毒胡萝卜素（Thapsigargin）	Calbiochem	586005
Sylgard 184 硅弹性体试剂盒	Dow Corning	3097358-1004
HIPEC R6101 半导体防护涂层	Dow Corning
63-500 系列高性能隔振实验台	Technical Manufacturing Corp.	63-540
EPC 10 膜片钳放大器及前置放大头级	HEKA Instruments
显微操作器	Sutter Instrument Co.	MP-285
配备40倍油镜的奥林巴斯IX71倒置显微镜	Olympus Corporation	1X71
Windows 计算机	Dell
Pulse 软件	HEKA Instruments
Origin 科学绘图与分析软件	OriginLab
膜片钳移液电极拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-97
含丝硼硅酸盐玻璃（外径：1.5 mm，内径：1.10 mm）	Sutter Instrument Co.	BF150-110-7.5
Narashige’s 微电极烘烤仪	Tritech Research, Inc.	MF-830
硅O型圈	McMaster-Carr	111 S70
25 mm 盖玻片	Fisher Scientific	12-545-102 25 mm 25CIR.-1