我们提供了一种用于记录外周血单个核细胞来源的人T淋巴细胞中钙释放激活钙（CRAC）电流的全细胞膜片钳技术的逐步实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
在T淋巴细胞中，细胞内Ca2+储存库的Ca2+耗竭会激活质膜上的Ca2+通道，这类通道被称为钙库操纵性钙（CRAC）通道。CRAC通道在调控T细胞增殖和基因表达中发挥重要作用。T细胞中CRAC通道功能异常与严重联合免疫缺陷病及自身免疫性疾病密切相关1, 2。研究人类T细胞中CRAC通道的功能，可能揭示调控正常免疫应答的新分子机制，并阐明相关人类疾病的病因。膜电流的电生理记录是评估通道功能特性及其调控机制最准确的方法。对Jurkat T细胞（一种人类白血病T细胞系）中CRAC通道电流的电生理记录最早于20多年前完成3，然而在正常人T细胞中记录CRAC电流仍是一项具有挑战性的任务。记录正常T细胞中CRAC通道电流的困难在于，来源于血液的T淋巴细胞体积远小于Jurkat T细胞，因此内源性的全细胞CRAC电流幅值非常低。本文中，我们提供了一种常规使用的分步操作流程，用于记录从健康志愿者外周血中分离的静息人T细胞中经CRAC通道介导的Ca2+或Na+电流。本方法借鉴了用于记录Jurkat T细胞及活化人T细胞中CRAC电流的已有实验流程4-8。
方案
1. 静息人T淋巴细胞的制备
- 使用 RosetteSep 人 T 细胞富集试剂和 RosetteSep 密度介质，根据制造商说明书从人血液样本中纯化 T 细胞。所得细胞群体应包含 95% CD3+ 静息 T 细胞。我们依据加州大学戴维斯分校机构审查委员会批准的方案，从健康志愿者外周血样本中纯化人 T 淋巴细胞。
- 分离后，将静息 T 细胞重悬于细胞培养基中，细胞密度为 0.5 x 106 细胞/mL，培养基成分为含谷氨酰胺和 HEPES 的 RPMI-1640 培养基，并添加 10% 胎牛血清、2% GlutaMAX-I、1% RPMI 1640 维生素溶液、1% RPMI 1640 氨基酸溶液、1% 丙酮酸钠和 0.03% β-巯基乙醇。
- 将细胞悬液置于细胞培养瓶中，在 37°C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育，实验前最多可维持 24 小时。
2. 记录室的制备
- 制备记录室所需材料如下：a) 硅胶O形圈，b) 经70%乙醇和蒸馏H2O清洗的圆形25 mm盖玻片，c) 按照生产商说明配制的混合Sylgard184，以及d) 两个60 × 15 mm的培养皿。
- 将约0.5 mL混合Sylgard184加入一个60 × 15....
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讨论
在静息人T细胞中进行CRAC电流的电生理学研究是一项具有挑战性的任务，因为这些细胞的内源性CRAC电流幅值较小，其原因是细胞尺寸小（静息人T细胞的直径范围为5-8 μm）。本文中，我们提供了一种逐步操作流程，用于可靠地记录从外周血单个核细胞中分离出的静息人T淋巴细胞中的CRAC电流。该技术使我们能够研究静息T细胞中CRAC通道的生理特性及功能表达，从而更深入地理解正常与病理状态下免疫细胞反应的本质。利用本实验方案，不仅可以检测静息人T细胞中的CRAC电流，还可用于其他免疫细胞，如活化人T细胞、单核细胞和巨噬细胞中的CRAC电流测量。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢加利福尼亚大学戴维斯分校生理学与膜生物学系为我们提供了研究离子通道所需的设施和优良环境。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人T细胞富集鸡尾酒试剂 RosetteSep | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| RosetteSep 密度介质 | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| 含谷氨酰胺/HEPES的RPMI 1640培养基 | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| 胎牛血清 | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I（100倍溶液） | Invitrogen | 35050 | |
| RPMI 1640 维生素溶液（100倍） | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| 1640 氨基酸溶液（50倍） | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-巯基–乙醇 | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| 三磷酸肌醇 | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| 聚-L-赖氨酸氢溴酸盐 | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| 氯化镧 | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| 毒胡萝卜素（Thapsigargin） | Calbiochem | 586005 | |
| Sylgard 184 硅弹性体试剂盒 | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| HIPEC R6101 半导体防护涂层 | Dow Corning | ||
| 63-500 系列高性能隔振实验台 | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| EPC 10 膜片钳放大器及前置放大头级 | HEKA Instruments | ||
| 显微操作器 | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| 配备40倍油镜的奥林巴斯IX71倒置显微镜 | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Windows 计算机 | Dell | ||
| Pulse 软件 | HEKA Instruments | ||
| Origin 科学绘图与分析软件 | OriginLab | ||
| 膜片钳移液电极拉制仪 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 含丝硼硅酸盐玻璃（外径：1.5 mm，内径：1.10 mm） | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Narashige’s 微电极烘烤仪 | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| 硅O型圈 | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| 25 mm 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
参考文献
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan,
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