本文介绍了一种快速分离脑和脊髓组织中单个核细胞的高效方案，所获细胞可有效用于流式细胞术分析。
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本文内容
摘要
摘要
在感染、创伤、自身免疫或神经退行性疾病过程中，通常需要分离浸润中枢神经系统（CNS）的免疫细胞，以明确其表型和效应功能。组织化学方法对于确定浸润细胞的定位以及分析相关的中枢神经系统病理变化具有重要作用。然而，原位组织化学和免疫荧光染色技术在单次实验中可使用的抗体数量有限，限制了对特定组织内免疫细胞亚群的表征。因此，结合组织学方法与流式细胞术进行免疫表型分析，对于全面表征局部中枢神经系统浸润细胞的组成至关重要。本方案基于通过非连续Percoll梯度分离中枢神经系统细胞悬液。本文介绍了一种快速分离脑和脊髓组织中单个核细胞的高效方案，所获得的细胞可用于单一样本中多种免疫细胞群体的流式细胞术鉴定。
方案
试剂的制备
通过将9份Percoll与1份不含Ca++和Mg++的10倍浓度HBSS混合，制备每脑4 ml的储备等渗Percoll（SIP）。
将SIP配制为不含Ca++和Mg++的1X HBSS中的70%溶液，每份2 ml分装至15 ml聚丙烯圆锥管中，每管对应一份脑组织。
注意：建议 Percoll 在室温下使用，如果在低温下使用，细胞容易聚集，导致细胞分离效率降低。
组织采集与匀浆化
麻醉小鼠，并通过左心室灌注冰冷的1× HBSS。解剖脑和脊髓，并将其置于不含酚红的RPMI培养基中，直至所有小鼠均被处死。
将组织置于含有 3 ml RPMI 的 7 或 15 ml Dounce 匀浆器中，先用松配合的研杵（A 型）轻轻制成细胞悬液，再用紧配合的研杵（B 型）进一步解离组织。用 RPMI 将细胞悬液补至 7 ml。
梯度设置
向细胞悬液中加入 3 ml SIP，使 SIP 终浓度为 30%
将10 mL细胞悬液缓慢地加至70% SIP上方。这是实验过程中最关键的一步，应使用设置为重力模式的移液器辅助装置，避免70%和30%溶液混合。在70%与30%溶液交界处应能观察到一条非常清晰的水平分界线。
在18°C条件下以500×g离心30分钟。确保离心机停止时使用最小或无刹车，以免干扰中间相。
使用移液管轻轻移除管顶部的碎片层，并将70%-30%界面层的2.0–3.0 ml收集至含有8 ml 1× HBSS的干净锥形管中。确保含有界面层的Percoll溶液被稀释约三倍，轻轻颠倒混匀数次，然后在18°C下以500×g离心7分钟。
将沉淀物重悬于1 ml细胞染色缓冲液中，转移至1.5 ml离心管，于4°C下以10,000G离心1分钟，再洗涤一次。
抗体染色
将沉淀重悬于50 μl细胞染色缓冲液中，其中含有1:200稀释的纯化抗小鼠CD16/CD32抗体，用于阻断Fc结合位点。冰上孵育10分钟。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
加入50 μl抗体混合液，在冰上孵育30分钟。每种抗体均需预先进行滴定，以确定最佳稀释比例。根据您所使用的流式细胞仪的激光器和滤光片配置，选择合适的荧光染料组合。
用细胞染色缓冲液洗涤细胞，将沉淀重悬于100–200 μl细胞染色缓冲液中，立即在流式细胞仪上进行分析；或者，也可将细胞重悬于PBS中配制的2%多聚甲醛（PFA）中，于4°C过夜保存。
代表性结果：
离心梯度后，70%-30% 介相应呈现清晰的白色环状结构，从未经处理的小鼠中回收的细胞数量通常为每只小鼠 3-5 × 105 个细胞（包括脑和脊髓）。炎症性脑组织中的炎性细胞数量可能因中枢神经系统损伤或疾病模型的不同而有所差异（图1）。
图1. 从正常小鼠和疾病高峰期EAE小鼠脑组织中分离单核细胞。脑组织细胞悬液通过不连续的70%/30% Percoll梯度离心进行分离。细胞染色时，先在冰上用Fc阻断剂孵育，随后加入抗CD45抗体，冰上孵育30分钟。细胞用细胞染色缓冲液洗涤，并在LSR-II流式细胞仪检测前用2%多聚甲醛固定。Y轴显示CD45荧光强度，可观察到三个不同的细胞群。通过使用其他特异性抗体进一步表征CD45hi浸润细胞的免疫表型，并随后通过流式细胞术进行分析。
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讨论
多年来，研究人员一直采用细胞表面标志物分析方法来研究正常和炎症小鼠组织中中枢神经系统（CNS）的白细胞1-3。细胞分离方案通常基于密度梯度离心法对小胶质细胞和白细胞进行分离4。本文介绍了一种利用不连续Percoll梯度快速高效分离CNS白细胞的方法。细胞分离后，可通过多种抗体（如但不限于CD45、CD4、CD8、CD11b、CD19等）染色，识别在特定病理条件下浸润中枢神经系统的免疫细胞群体。使用抗CD45抗体染色后，流式细胞术可鉴定出三个不同的细胞群：（1）CD45阴性群体，主要包括神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞及其他神经细胞；（2）CD45lo（低表达）或中间表达群体，主要为处于监视状态的小胶质细胞；（3）CD45hi（高表达）群体，主要由浸润的血液来源白细胞组成。研究髓系细胞在中枢神经系统病理过程中的作用一直具有挑战性。然而，结合多种细胞表面标志物5, 6以及骨髓嵌合小鼠模型的应用，已为理解髓系细胞在中枢神经系统炎症中的功能差异提供了重要线索2, 7, 8。通过髓鞘肽段免疫后，可诱导自身免疫反...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国家多发性硬化症协会（TA 3021-A1/T，资助编号授予 AEC）和德克萨斯大学圣安东尼奥分校资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
组织匀浆与梯度分离
流式细胞术
|
参考文献
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