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方法文章

多尺度数字化神经元形态的自动Sholl分析

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DOI：

10.3791/2354

⸱

2010年11月14日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers University, 2Graduate Program in Biomedical Engineering, Rutgers University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们开发了一款用于分析神经元形态的计算机程序。结合两种现有的开源分析工具，该程序可进行Sholl分析，并确定神经突的数量、分支点数量以及神经突末端数量。这些分析能够揭示神经突形态的局部变化。

摘要

神经元形态在决定神经元功能和通讯方式方面起着重要作用1-3。具体而言，它影响神经元接收其他细胞输入信号的能力2，并参与动作电位的传导4,5。神经突的形态还影响信息的处理方式。树突形态的多样性有助于局部和长距离信号传递，使单个神经元或神经元群体能够在神经网络中执行特定功能6,7。在多种疾病状态下，已观察到树突形态发生改变，包括树突断裂和分支模式的变化，这些疾病包括阿尔茨海默病8、精神分裂症9,10和智力障碍11。深入了解塑造树突形态的因素，并识别树突形态的变化，对于理解神经系统的正常功能与功能障碍至关重要。

神经突形态通常通过Sholl分析以及计数神经突数量和分支末端数量来进行分析。该分析通常应用于树突，但也可用于轴突。手动进行此类分析既耗时，又不可避免地因实验者的主观偏见和操作不一致而引入变异性。Bonfire程序是一种半自动化的树突和轴突形态分析方法，其建立在现有开源形态分析工具的基础之上。我们的程序通过对神经突树的不同亚区域进行Sholl分析，从而检测树突和轴突分支行为的局部变化。例如，Sholl分析不仅针对整个神经元进行，还针对各子集的突起（初级、次级、末端、根部等）分别进行。树突和轴突的模式受到多种细胞内和细胞外因素的影响，其中许多因素具有局部作用。因此，最终的神经突树形态是特定过程作用于特定神经突的结果，这就需要在更小的尺度上进行形态学分析，以观察这些局部差异12。

Bonfire 程序需要使用两种开源分析工具：ImageJ 的 NeuronJ 插件和 NeuronStudio。神经元在 ImageJ 中进行追踪，而 NeuronStudio 用于定义神经突之间的连接关系。Bonfire 包含多个使用 MATLAB（MathWorks）编写的自定义脚本，用于将数据转换为适合进一步分析的格式、检查用户错误，并最终执行 Sholl 分析。最后，数据被导出至 Excel 进行统计分析。图 1展示了 Bonfire 程序的流程图。

方案

1. 开始前准备：

1）E18 大鼠解剖：

E18海马神经元的标准解剖方法已有文献描述13。为了使用Bonfire程序分析神经突的形态学特征，必须获取单个神经元的8位.tif图像。这可以通过多种方式实现，具体取决于所采用的实验方案。神经元可接种于足够低的密度，使单个神经元出现在显微镜视野中。或者，对于在高密度培养中生长的单个神经元，可采用多种转染方法将其转染表达荧光蛋白的质粒，以实现成像。

2）软件需求与安装：

  1. 为了运行 Bonfire 程序，必须在计算机上安装由 NIH 提供的 ImageJ 软件的 NeuronJ 插件以及 NeuronStudio。相关软件包可通过以下网站获取：
    ImageJ - http://rsbweb.nih.gov/ij/
    NeuronJ - http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
    NeuronStudio - http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html
  2. Bonfire 程序可从 http://lifesci.rutgers.edu/~firestein 获取。该网站同时提供 Bonfire 用户手册。此外，Bonfire 的首次描述发表于 Langhammer et al, Cytometry 2010。我们的所有数据均使用 Windows 操作系统进行分析。

3）图像分辨率调整：

您需要根据要分析的图像的分辨率调整 Bonfire 程序。在 Bonfire 程序的 bonfire_parameters 部分，将变量 pix_conv 的当前值替换为您的图像的分辨率值（μm/像素）。

2. 文件结构：

为了使 Bonfire 能够分析您的数据，文件必须按照此特定结构进行组织（图 2）。您需要具备：

  • 一个主文件夹
  • 子文件夹（包含不同实验条件的文件夹）
  • 细胞图像文件（文件名为 filename.tif 的文件），分别存放在不同条件的文件夹中
  • 一个包含 Bonfire Matlab m 文件的 Bonfire 文件夹（也位于主文件夹中）

3. 在 NeuronJ 中追踪神经元：

  1. 准备图像以进行描迹
    1. 在 NeuronJ 工具栏中选择“打开”按钮，打开您要描迹的图像。
    2. 通过选择“最大化”按钮调整图像大小。
    3. 通过在 NeuronJ 工具栏中选择“图像”，然后选择“调整亮度/对比度”，调节图像的亮度和对比度，以便能够清晰地观察所有神经突。
  2. 在 NeuronJ 中描迹细胞体，并将该描迹标识为“Type 06”
    1. 在 NeuronJ 工具栏中选择“添加描迹”按钮。
    2. 沿细胞体的边缘进行描迹。
    3. 在 NeuronJ 工具栏中选择“标记描迹”按钮。
    4. 在“描迹 ID”下拉菜单中选择“N1”。
    5. 在 NeuronJ：属性窗口中选择“Type 06”，然后点击“确定”。
  3. 在 NeuronJ 中描迹神经突
    1. 在 NeuronJ 工具栏中选择“添加描迹”按钮。
    2. 沿每条神经突分支添加描迹。根据实验需求，您可以仅选择树突或轴突。
    3. 建议所绘制的每一段描迹在分支点处停止，每个子分支应从该分支点开始作为一条新的描迹。
    4. 在 NeuronJ 工具栏中选择“保存描迹”按钮。
    5. 将刚刚创建的描迹文件保存到与原始图像文件相同的文件夹中。
  4. 从 NeuronJ 导出描迹文件和描迹标识文件
    必须从 NeuronJ 导出两类文件，并与 .tif 和 .ndf 文件一起保存到相应的条件文件夹中。
    1. 在 NeuronJ 工具栏中选择“导出描迹”按钮。
    2. 在“NeuronJ：导出”对话框中选择“制表符分隔的文本文件：每个描迹单独保存为一个文件”选项，然后点击“确定”。
    3. 允许 NeuronJ 自动选择文件名和保存位置。
    4. 在 NeuronJ 工具栏中选择“测量描迹”按钮。
    5. 在“NeuronJ：测量”窗口中选择“显示描迹测量结果”选项，然后点击“运行”。
    6. 在“NeuronJ：描迹”窗口中选择“文件”。
    7. 选择“另存为”，并将文件命名为 filename_info。其中“filename”必须与原始图像文件的名称完全一致（包括大小写），后接 _info，且不应包含三个字母的文件扩展名。例如，若原始图像文件名为 Cell20.tif，则此文件应命名为“Cell20_info”。请检查您的计算机不会自动添加 .xls 扩展名；如果自动添加，必须手动删除该扩展名。

4. 使用 Bonfire 从 NeuronJ 数据构建初步的 .swc 文件：

  1. 使用 'bonfire_load' 重新组织文件夹
    1. 通过双击图标打开 Matlab。
    2. 点击命令窗口右上角的 ' ' 按钮。
    3. 在“浏览文件夹”窗口中，选择主文件夹中的“Bonfire”文件夹。
    4. 在 Matlab 命令窗口中输入 'bonfire_load' 并按回车键。
    5. 在“浏览文件夹”窗口中选择要分析的条件文件夹，然后点击“确定”。
    6. 此操作将通过创建包含每个单独细胞全部数据的子文件夹来重新组织文件夹结构。
  2. 使用 'bonfire_ndf2swc' 创建 filename_prelim.swc 文件
    1. 在命令窗口中输入 'bonfire_ndf2swc' 并按回车键。
    2. 在“浏览文件夹”窗口中选择刚刚使用 'bonfire_load' 重新组织过的相同条件文件夹，然后点击“确定”。
    3. 此操作将在每个细胞文件夹中为所选条件创建一个 .swc 文件。每个细胞文件夹现在将包含 5 个文件：原始 .tif 图像、.ndf 文件、_info 轨迹标识文件、一个 .txt 文件和一个 .swc 文件。

5. 使用 NeuronStudio 完成 .swc 文件的编辑：

  1. 在 NeuronStudio 中打开并校准神经元图像
    1. 打开 NeuronStudio 程序。
    2. 在 NeuronStudio 工具栏中选择 文件→打开。
    3. 找到您要编辑的神经元的 .tif 图像并打开。
    4. 选择 运行→设置，在“体素大小”窗口的 3 个（X、Y、Z）框中均输入“1”。
    5. 选择 文件→导入 SWC，选择相应的 .swc 文件。图像上将叠加显示追踪图像，细胞胞体应被一个红色圆圈覆盖。
  2. 使用 NeuronStudio 连接神经突
    1. 使用 NeuronStudio 中的工具正确识别分支点和末端点（建议在分析数据前先熟悉 NeuronStudio 的功能和快捷键）。
    2. 具体操作：使用“神经突工具”连接节点，确保：
      • 每个分支点（黄色节点）只能产生两条分支
      • 所有轨迹均与胞体连续（仅有一个红色节点）
  3. 从 NeuronStudio 导出数据
    1. 选择 文件→保存神经突（以默认名称保存）。
  4. 使用 'bonfire_trace_check' 检查 .swc 文件中的错误
    1. 在 MATLAB 命令窗口中输入 'bonfire_trace_check' 并按回车。
    2. 在“浏览文件夹”窗口中选择包含您刚处理数据的条件文件夹，然后点击“确定”。
    3. 如果该文件夹中任何图像存在错误，程序将输出显示错误位置的图像。
    4. 在 NeuronStudio 中修正错误
      1. 打开在导出步骤中保存的图像文件。
      2. 定位并修复问题。
      3. 点击 文件→保存神经突。
      4. 对其他需要修复的图像重复上述步骤。
      5. 重新运行 'bonfire_trace_check'（5.4）。

6. 使用“bonfire”从.swc文件中提取形态学数据：

  1. 在命令窗口中输入“bonfire”，然后按回车键。
  2. 在“浏览文件夹”窗口中，选择包含要分析数据的条件文件夹，然后点击“确定”。
  3. Bonfire 分析将为每个被分析的神经元生成一个窗口，其中绘制了神经元形态以及分析中使用的 Sholl 环。此外，“bonfire”命令还将生成一个 .mat 文件，其中包含从分析中获取的所有形态学信息。

7. 使用“bonfire_results”查看数据：

  1. 在 Matlab 命令窗口中输入 'bonfire_results'。
  2. 在“浏览文件夹”窗口中选择您要查看的条件对应的条件文件夹，然后点击“确定”。
  3. “浏览文件夹”窗口将暂时关闭并重新打开，允许您选择其他要查看的条件文件夹。
  4. 完成条件文件夹的选择后，点击“取消”以退出选择过程。
  5. 'Bonfire_results' 将返回汇总图表，其中包含您所选条件文件夹中的数据。

8. 使用“bonfire_export”将数据导出至 Excel：

  1. 在命令窗口中输入“bonfire_export”。
  2. 在“浏览文件夹”窗口中，选择包含您要导出数据的条件文件夹，然后点击“确定”。bonfire_export 将创建形态学数据的 Excel 文件，并将其保存至所选的条件文件夹中。

9. 代表性结果：

Bonfire 程序在包含两个条件的数据集上生成数据的示例如下所示 图3在此示例中，条件1的神经元在胞体远端含有更多的神经突。该现象可在示例图像中观察到（图3B）以及总树突分支的Sholl曲线中图 3A) 以及末端点数量的图中（图3C）。此外，由于 Bonfire 程序还能对图像的子区域进行 Sholl 分析，因此我们能够更具体地识别出 neurite 增加的类型。3 的交点总数rd 一级或更高级别的神经突图3F以及中间和末端神经突的总数（图3G远离细胞体的位置，其数量有所增加。这些趋势在以下情况中同样可以观察到 图3D 和 3E.

使用 NeuronJ、Bonfire、NeuronStudio 进行神经元追踪的工作流程图；细胞形态学分析。
图 1：Bonfire 程序的流程图。 使用 ImageJ 对神经元进行追踪。然后将数据导出，并由 Bonfire 程序转换为初步的 .swc 文件。使用 NeuronStudio 定义神经突的连接关系。Bonfire 检查错误后，计算 Sholl 曲线、初级、次级及更高阶神经突的数量，以及分支点和神经突末端的数量。最后，将数据导出至 Excel 进行统计分析。

实验数据存储的文件目录结构，显示 Windows 系统中的文件夹和 .tif 文件。
图 2：Bonfire 分析所需的文件结构。 文件结构必须与此一致，否则程序将无法正常运行。文件夹和文件的名称以及数量可以更改。

Sholl 分析图、神经元分支示意图、数据比较、实验神经科学结果
图 3：Bonfire 程序的示例输出数据。 A) 总 Sholl 曲线。B) 两种条件下倒置图像的示例。C) 每个细胞的平均分支点数和末端点数。D) 每个细胞的初级、次级以及三级或更高级神经突的平均数量。E) 每个细胞的根段、中间段和末端神经突的平均数量。F) 按神经突身份分类的 Sholl 分析曲线。神经突分为初级、次级或三级及以上类别。G) 按神经突身份分类的 Sholl 分析曲线。神经突分为根段、中间段或末端段。

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讨论

Bonfire 程序是一种用于分析树突和轴突形态的半自动化软件。与手动分析相比，它显著提高了Sholl分析的效率和准确性。此外，Bonfire 程序会在分析过程的每一步保存数据，从而可以对数据进行审计并验证分析结果的准确性。因此，数据分析任务可分配给多个操作人员，而不会影响分析的准确性。最后，通过在图像的子区域上执行分析，该程序能够识别出仅对整个树突或轴突分支结构进行Sholl分析时容易遗漏的局部分支变化。我们的程序能够确定特定亚群神经突相对于细胞体的空间排布方式。因此，Bonfire 程序生成的数据能够很好地反映图像中的分支模式。

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披露

作者声明无竞争利益。资助机构在Bonfire的开发过程中未发挥科学作用。

致谢

本工作部分得到了Busch生物医学基金、美国国家科学基金会（NSF）IBN-0548543号基金、NSF IBN-0919747号基金、March of Dimes基金会1-FY04-107号基金以及March of Dimes基金会1-FY08-464号基金（授予B.L.F.）的支持。M.K.K.和C.G.L.得到了美国国立卫生研究院（NIH）生物技术培训基金T32 GM008339-20的支持，C.G.L.还获得了新泽西州脊髓损伤研究委员会博士前奖学金08-2941-SCR-E-0的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NeuronJ 插件http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/
ImageJ 软件http://rsbweb.nih.gov/ij/
Bonfire 程序http://lifesci.rutgers.edu/~firestein
NeuronStudiohttp://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html
MatLab 程序Mathworks

参考文献

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  13. Firestein, B. L. Cypin: a cytosolic regulator of PSD-95 postsynaptic targeting. Neuron. 24, 659-672 (1999).

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