寡核苷酸可用于在Anopheles gambiae和Anopheles stephensi细胞中特异性定点替换转染靶基因的单个核苷酸。
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摘要
摘要
疟原虫 疟疾的病原体疟原虫通过受感染蚊子的叮咬传播 按蚊属 每年导致超过2.5亿例新感染的蚊子。尽管数十年的研究，目前仍无有效的疟疾疫苗，凸显了开发新型防控策略的迫切需求。一种创新方法是利用基因改造蚊子，以有效控制疟原虫的传播。通过靶向诱变对蚊子细胞信号通路进行人为改造，已被发现可调控疟原虫的发育。 1从这些研究中，我们能够开始识别可用于转化的潜在基因靶点。传统的靶向诱变依赖于目标基因与大片段DNA分子之间的同源重组。然而，构建和使用此类复杂的DNA分子来获得稳定转化的细胞系，成本高昂、耗时较长，且效率通常较低。因此，采用锁核酸修饰的寡核苷酸（LNA-ONs）的策略为向附加体及染色体DNA基因靶点引入人工单核苷酸替换提供了一种有效的替代方法（详见综述于 2LNA-ON介导的靶向诱变已被用于在酵母和小鼠的培养细胞中对目的基因引入点突变 3,4我们在此证明，LNA-ONs可用于在转染的附加体型靶标中引入单个核苷酸改变，从而在两种情况下均实现由蓝色荧光蛋白（BFP）表达向绿色荧光蛋白（GFP）表达的转换 Anopheles gambiae 和 Anopheles stephensi 细胞。这一转化首次证明，蚊虫细胞中靶基因的有效诱变可由LNA-ON介导，提示该技术可能适用于染色体靶标的诱变 体外 和 体内.
方案
- 开始实验方案之前，必须确认实验所用的蚊子细胞处于健康状态，且若为贴壁细胞，则融合度约为80%（图1）。过度生长或不健康的细胞将导致转染效率低下，并产生不一致的结果。
- 使用前将所有培养基在28°C水浴中预热30分钟。
- A. stephensi MSQ43细胞需要E5培养基：含谷氨酰胺的MEM，Earle's配方，5%热灭活FCS，0.2% D-葡萄糖，1%青霉素-链霉素抗生素，以及1%非必需氨基酸。
- A. gambiae SUA5B细胞需要S2培养基：Schneider's Drosophila培养基，5%热灭活FCS，以及1%青霉素-链霉素抗生素。
- 将所有转染试剂材料、质粒和寡核苷酸从冻存状态解冻后置于冰上保存。
- 所有操作均应在组织培养超净台内采用无菌技术进行。
- 对于贴壁细胞（A. gambiae SUA5B，A. stephensi MSQ43），吸除旧培养基时避免扰动细胞，加入等体积已预热至28°C的新鲜培养基，然后用移液器将细胞从培养瓶底部轻轻吹打下来。
- 应测定细胞浓度，并调整至终浓度为1×106 个细胞/mL。在准备转染试剂材料期间，细胞可在室温下保存。
- 向6孔板的每孔中加入1 mL蚊子细胞（1×106 个细胞/mL）。为每种实验条件设置独立的培养板（见下文）。
表I为常规转染的移液方案。表II列出了使用BFP特异性LNA-ONs成功实现单核苷酸突变的五种测试条件。前两种条件pGFP和pBFP分别为阳性和阴性对照。其余条件为含有不同浓度BFP特异性LNA-ONs的pBFP实验组。在步骤8至12中，应根据各实验条件加入相应体积的试剂。 - 将质粒DNA转移至无菌的1.5 mL微量离心管中，并加入适量EC缓冲液。
- 对于1 μL质粒DNA（1 μg/μL），加入99 μL EC缓冲液。
- 对于1 μL pGFP（1 μg/μL），加入99 μL EC缓冲液。
- 对于1 μL pBFP（1 μg/μL），加入99 μL EC缓冲液。
- 对于1 μL pBFP（1 μg/μL）和1 μL ON（μg/μL），加入98 μL EC缓冲液。
- 对于1 μL pBFP（1 μg/μL）和5 μL ON（1 μg/μL），加入94 μL EC缓冲液。
- 对于1 μL pBFP（1 μg/μL）和10 μL ON（1 μg/μL），加入89 μL EC缓冲液。
- 随后根据所用DNA每1 μg缓慢加入Enhancer。
- 对于1 μL质粒DNA，加入8 μL Enhancer。
- 对于1 μL pGFP，加入8 μL Enhancer。
- 对于1 μL pBFP，加入8 μL Enhancer。
- 对于1 μL pBFP和1 μL ON，加入16 μL Enhancer。
- 对于1 μL pBFP和5 μL ON，加入48 μL Enhancer。
- 对于1 μL pBFP和10 μL ON，加入88 μL Enhancer。
- 将DNA/缓冲液/Enhancer混合物涡旋震荡1秒，并确保所有溶液均位于管底。然后在室温下孵育5分钟。
- 根据每1 μg质粒DNA加入Effectene试剂，并涡旋震荡10秒。确认所有溶液均位于管底，然后在室温下孵育10分钟。
- 对于1 μL质粒DNA，加入10 μL Effectene（表I）。
- 对于1 μL pGFP，加入10 μL Effectene（表II）。
- 对于1 μL pBFP，加入10 μL Effectene（表II）。
- 对于1 μL pBFP和1 μL ON，加入20 μL Effectene（表II）。
- 对于1 μL pBFP和5 μL ON，加入60 μL Effectene（表II）。
- 对于1 μL pBFP和10 μL ON，加入110 μL Effectene（表II）。
- 通过逐滴加入预热的培养基，将每管总体积补至1000 μL。若加入培养基过快，DNA可能在此时发生沉淀。用移液器轻轻吹打3–4次以混匀。
- 对于1 μL质粒DNA，加入882 μL培养基（表I）。
- 对于1 μL pGFP，加入882 μL培养基（表II）。
- 对于1 μL pBFP，加入882 μL培养基（表II）。
- 对于1 μL pBFP和1 μL ON，加入864 μL培养基（表II）。
- 对于1 μL pBFP和5 μL ON，加入792 μL培养基（表II）。
- 对于1 μL pBFP和10 μL ON，加入702 μL培养基（表II）。
- 接下来，将适量的DNA/Enhancer/Effectene混合液逐滴缓慢加入各孔中。
- 轻轻摇动培养板，以确保细胞和转染混合物分布均匀。将细胞置于正常培养条件下孵育。
- 转染后一天，轻轻吸除培养基，并缓慢替换为等体积的新鲜预热培养基。此操作过程中应注意不要扰动各孔底部的细胞层。
- 转染后两天，在荧光显微镜下观察转染了pGFP的阳性对照细胞，以评估转染效率（图2）。
- SUA5B细胞生长迅速，容易过度融合。转染后四天，通过吸除旧培养基并缓慢加入等体积的新鲜预热培养基来稀释细胞。
- 向各孔加入新培养基后，用移液器反复吹打使所有细胞从孔底脱离，弃去一半体积（1 mL）的细胞悬液，并加入1 mL新鲜预热培养基，使终体积恢复至2 mL。
- 每日检查细胞状态，确保其健康且未过度生长，必要时进行稀释。
- 转染后在正常培养条件下继续培养细胞5至7天，然后收集细胞用于分析。
- 转染后5至7天，通过吸除所有孔中的旧培养基，并向每孔加入1 mL无菌室温PBS来收集细胞。
- 用移液器反复吹打使细胞从孔底脱离，将细胞悬液转移至5 mL带盖离心管中，并立即通过流式细胞术进行分析。
代表性结果
图 1. 未转染的健康A. stephensi MSQ43（A）和A. gambiae SUA5B（B）细胞，汇合度约为80%。
图2. A. stephensi MSQ43 (A) 和 A. gambiae SUA5B (B) 细胞转染表达GFP的阳性对照质粒。
图3. 流式细胞术数据证实，在转染BFP特异性锁核酸修饰寡核苷酸（LNA-ONs）后，通过单个核苷酸的诱变实现了BFP向GFP的转化。SUA5B细胞分别转染表达GFP的质粒（pGFP）作为阳性对照、表达BFP的质粒（pBFP）作为阴性对照，或共转染pBFP与不同浓度的BFP特异性LNA-ONs。（A）流式细胞术数据分析的设门策略，从左至右依次显示：活细胞的前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）、碘化丙啶（PI）阴性细胞，以及转染后第五天的GFP阳性细胞。（B）转染pBFP并加入不同浓度LNA-ONs后，GFP阳性细胞百分比的统计图，数据来自（A）所示结果。
表I. 转染条件。
表 II. 图1中使用的转染条件。
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讨论
在此我们介绍一种 体外 方法及证据：转染LNA-ONs后对附加体基因靶标中单个核苷酸进行靶向转换 A. stephensi 和 A. gambiae 细胞。LNA-ON介导的基因转换需要诱导位点特异性的DNA修复反应；我们的数据表明，蚊虫细胞能够支持这种位点特异性诱变机制。尽管本文所述方法基于游离型靶标的转换，但我们的数据提示，LNA-ON介导的转换可如其他系统中那样，在蚊虫细胞中进一步优化以适用于染色体靶标。因此，基因转换将有助于在无需复杂操作流程和长期药物筛选的情况下，建立稳定转化的蚊虫细胞系。此外，现有的基于活细胞中mRNA特异性荧光标记的技术可用于分选和富集染色体基因靶标已发生转换的蚊虫细胞，从而推动生物学研究。 5-7.
该方法的成功关键在于使用密度为70-80%的健康细胞。此外，在转染过程的每一步中，都必须通过肉眼观察溶液是否有沉淀，以确保质粒或LNA-ONs未从溶液中析出。本方案的一个可能修改是：在开始转染前24小时接种细胞，这建议用于生长缓慢或敏感的细胞系。我们发现质粒DNA与LNA-...
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致谢
我们感谢加利福尼亚国家灵长类研究中心的Abbie Spinner在流式细胞术方面提供的协助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID）资助，项目编号为AI073745、AI080799和AI078183。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Effectene 转染试剂 | Qiagen | 301425 | |
| GFP对照质粒（pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg） | Invitrogen | K4935-00 | |
| BFP 质粒 (pcDNA5/FRT/TO) | Concordet 博士惠赠3 | ||
| LNA-ONs | Concordet 博士惠赠3 | ||
| MEM，厄尔液’含谷氨酰胺 | Invitrogen | 11095 | |
| 胎牛血清（FCS） | Invitrogen | 16000 | |
| 施耐德’s 果蝇 培养基 | Invitrogen | 11730 | |
| 非必需氨基酸 | Invitrogen | 11140 | |
| 10% D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| 青霉素-链霉素抗生素 | Invitrogen | 15140 | |
| 6孔培养板 | 康宁 | 3516 |
参考文献
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
- Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
- Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
- Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
- Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
- Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
- Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
- Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).
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