寡核苷酸可用于在Anopheles gambiae和Anopheles stephensi细胞中特异性定点替换转染靶基因的单个核苷酸。
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摘要
摘要
疟原虫 疟疾的病原体疟原虫通过受感染蚊子的叮咬传播 按蚊属 每年导致超过2.5亿例新感染的蚊子。尽管数十年的研究，目前仍无有效的疟疾疫苗，凸显了开发新型防控策略的迫切需求。一种创新方法是利用基因改造蚊子，以有效控制疟原虫的传播。通过靶向诱变对蚊子细胞信号通路进行人为改造，已被发现可调控疟原虫的发育。 1从这些研究中，我们能够开始识别可用于转化的潜在基因靶点。传统的靶向诱变依赖于目标基因与大片段DNA分子之间的同源重组。然而，构建和使用此类复杂的DNA分子来获得稳定转化的细胞系，成本高昂、耗时较长，且效率通常较低。因此，采用锁核酸修饰的寡核苷酸（LNA-ONs）的策略为向附加体及染色体DNA基因靶点引入人工单核苷酸替换提供了一种有效的替代方法（详见综述于 2LNA-ON介导的靶向诱变已被用于在酵母和小鼠的培养细胞中对目的基因引入点突变 3,4我们在此证明，LNA-ONs可用于在转染的附加体型靶标中引入单个核苷酸改变，从而在两种情况下均实现由蓝色荧光蛋白（BFP）表达向绿色荧光蛋白（GFP）表达的转换 Anopheles gambiae 和 Anopheles stephensi 细胞。这一转化首次证明，蚊虫细胞中靶基因的有效诱变可由LNA-ON介导，提示该技术可能适用于染色体靶标的诱变 体外 和 体内.
方案
- 开始实验方案之前，必须确认实验所用的蚊子细胞处于健康状态，且若为贴壁细胞，则融合度约为80%（图1）。过度生长或不健康的细胞将导致转染效率低下，并产生不一致的结果。
- 使用前将所有培养基在28°C水浴中预热30分钟。
- A. stephensi MSQ43细胞需要E5培养基：含谷氨酰胺的MEM，Earle's配方，5%热灭活FCS，0.2% D-葡萄糖，1%青霉素-链霉素抗生素，以及1%非必需氨基酸。
- A. gambiae SUA5B细胞需要S2培养基：Schneider's Drosophila培养基，5%热灭活FCS，以及1%青霉素-链霉素抗生素。
- 将所有转染试剂材料、质粒和寡核苷酸从冻存状态解冻后置于冰上保存。
- 所有操作均应在组织培养超净台内采用无菌技术进行。
- 对于贴壁细胞（A. gambiae SUA5B，A. stephensi MSQ43），吸除旧培养基时避免扰动细胞，加入等体积已预热至28°C的新鲜培养基，然后用移液器将细胞从培养瓶底部轻轻吹打下来。
- 应测定细胞浓度，并调整至终浓度为1×106 个细胞/mL。在准备转染试剂材料期间，细胞可在室温下保存。
- 向6孔板的每孔中加入1 mL蚊子细胞（1×106 个细胞/mL）。为每....
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讨论
在此我们介绍一种 体外 方法及证据：转染LNA-ONs后对附加体基因靶标中单个核苷酸进行靶向转换 A. stephensi 和 A. gambiae 细胞。LNA-ON介导的基因转换需要诱导位点特异性的DNA修复反应；我们的数据表明，蚊虫细胞能够支持这种位点特异性诱变机制。尽管本文所述方法基于游离型靶标的转换，但我们的数据提示，LNA-ON介导的转换可如其他系统中那样，在蚊虫细胞中进一步优化以适用于染色体靶标。因此，基因转换将有助于在无需复杂操作流程和长期药物筛选的情况下，建立稳定转化的蚊虫细胞系。此外，现有的基于活细胞中mRNA特异性荧光标记的技术可用于分选和富集染色体基因靶标已发生转换的蚊虫细胞，从而推动生物学研究。 5-7.
该方法的成功关键在于使用密度为70-80%的健康细胞。此外，在转染过程的每一步中，都必须通过肉眼观察溶液是否有沉淀，以确保质粒或LNA-ONs未从溶液中析出。本方案的一个可能修改是：在开始转染前24小时接种细胞，这建议用于生长缓慢或敏感的细胞系。我们发现质粒DNA与LNA-.......
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致谢
我们感谢加利福尼亚国家灵长类研究中心的Abbie Spinner在流式细胞术方面提供的协助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID）资助，项目编号为AI073745、AI080799和AI078183。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Effectene 转染试剂 | Qiagen | 301425 | |
| GFP对照质粒（pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg） | Invitrogen | K4935-00 | |
| BFP 质粒 (pcDNA5/FRT/TO) | Concordet 博士惠赠3 | ||
| LNA-ONs | Concordet 博士惠赠3 | ||
| MEM，厄尔液’含谷氨酰胺 | Invitrogen | 11095 | |
| 胎牛血清（FCS） | Invitrogen | 16000 | |
| 施耐德’s 果蝇 培养基 | Invitrogen | 11730 | |
| 非必需氨基酸 | Invitrogen | 11140 | |
| 10% D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| 青霉素-链霉素抗生素 | Invitrogen | 15140 | |
| 6孔培养板 | 康宁 | 3516 |
参考文献
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R.
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