流感病毒A型的并发感染是无症状携带Streptococcus pneumoniae期间诱发侵袭性肺炎球菌疾病的因素之一。本文介绍了一种利用幼鼠建立混合感染的方法，用于研究这两种呼吸道病原体之间的协同作用。
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摘要
摘要
在1918年流感病毒大流行期间，全球约有5000万人死亡，其中大多数死亡病例并非单纯由流感病毒感染所致。相反，多数个体被认为死于继发性细菌感染，主要由细菌 肺炎链球菌 （肺炎链球菌）。在1957年亚洲流感病毒大流行期间以及流感病毒季节性暴发期间，均相继观察到流感病毒感染与肺炎链球菌感染之间的协同作用关系（详见综述于 1, 2）。在此，我们介绍一种用于研究流感病毒A与共感染导致发病率升高的潜在机制的实验方案。 S. pneumoniae 感染。我们建立了一种可靠的、可重复的新生小鼠模型，用于展示流感病毒感染定植有特定微生物的小鼠后所产生的影响。 S. pneumoniae通过本方案，我们首次揭示了共同饲养的新生小鼠之间肺炎链球菌传播的动力学特征 体内 成像 3.
方案
1. 发光型S. pneumoniae感染性菌种的制备
- 在含有10 ml Todd-Hewitt肉汤（添加0.5% w/v酵母提取物）的McCartney管中接种发光的S. pneumoniae，并加入一小块血琼脂，于37°C静置培养至光密度（600 nm）达到0.40–0.45。
- 将培养物置于湿冰上5分钟，以使细胞停滞在该生长阶段。
- 向10 ml处于对数中期生长的S. pneumoniae培养物中加入1 ml 80% (v/v)甘油，混匀后分装至所需体积，于-70°C保存。
- 通过在血琼脂平板上进行连续稀释并计数活菌，测定发光S. pneumoniae菌种的感染剂量。
2. 流感病毒A株的培养与毒种制备
- 在10日龄的鸡胚尿囊液中培养甲型流感病毒。
- 将含有甲型流感病毒的小瓶在37°C水浴中解冻。
- 利用光源照射气室（照蛋），在无血管覆盖的位置标记蛋壳上气室的边界。
- 用70%乙醇擦拭鸡蛋表面进行消毒，并擦净残留液体。
- 使用珠宝刻刀在标记点上方的气室顶部钻一个小孔。
- 将鸡蛋放置于蛋托中，使气室朝上，使用13mm 1mL注射器和26G针头通过蛋壳上的小孔向每个鸡蛋接种0.1mL适当稀释的甲型流感病毒。将针头垂直向下刺入尿囊腔，穿透气室膜。
- 用熔化的蜡密封小孔，并将鸡蛋置于35°C、加湿的孵蛋器中孵育2天。孵育2天后，通过照蛋检查血管是否存在以确认胚胎仍存活。若蛋内呈黑色，表明胚胎已死亡，应丢弃该蛋，不得用于甲型流感病毒的收获。
- 次日将鸡蛋置于4°C过夜，以杀死胚胎并收缩血管，从而减少血管破裂的风险；因为血液与病毒接触会导致病毒与红细胞结合。
- 第二天，用70%乙醇擦拭鸡蛋表面进行消毒。
- 在II级生物安全柜中操作，从鸡蛋中收集含有甲型流感病毒的尿囊液。去除蜡封后，使用弯头剪刀沿蛋顶部剪开，移除位于尿囊膜上方的气室部分。
- 使用无菌镊子刺破并掀开尿囊膜。
- 用10mL无菌移液管吸取尿囊液，同时用另一支无菌移液管将胚胎推至一侧。将收集的尿囊液汇集至50mL离心管中，并始终置于冰上。若尿囊液含有血液或卵黄，则不应加入总收集液中。
- 将尿囊液在室温下以2,000 rpm离心5分钟，以去除碎片。
- 将具有感染性的尿囊液分装至1–2 mL冻存管中，每管装量适宜，并储存在-70°C。
- 通过3次独立重复的噬斑形成实验（见下文）测定解冻后尿囊液中甲型流感病毒的滴度。每次实验应使用新的病毒分装样品。反复冻融会降低病毒的感染性滴度。
3. 用生物发光的S. pneumoniae 和/或甲型流感病毒经鼻感染小鼠
- 解冻生物发光的 S. pneumoniae 冻存菌种，并用 PBS 稀释至所需剂量。
- 用拇指和食指轻轻抓起 5 日龄小鼠，使其保持直立。使用移液器将生物发光的 S. pneumoniae 以 3μl 体积滴加至小鼠鼻孔处。待全部接种物吸入后，再将小鼠放回笼中。模拟感染时使用 3μl 的 PBS。
- 在用生物发光的 S. pneumoniae 定植后 3 至 9 天，解冻一份含有甲型流感病毒的羊水液等分试样，并用 PBS 稀释至所需浓度。按照步骤 3.2 所述方法，以 3μl PBS 体积对小鼠进行甲型流感病毒感染。模拟病毒感染时使用来自未感染鸡蛋的稀释羊水液 3μl。
- 每天通过观察小鼠的外观、行为、身体状况以及 ≤3 日龄小鼠是否存在乳斑，来监测其福利状况。应与实验动物兽医协商制定人道终点和干预标准指南（表 3）。
4. 使用 IVIS Spectrum（Caliper Life Sciences）进行生物发光成像
- 在注射用水中配制每毫升含氯胺酮 0.75 mg 和赛拉嗪 1.76 mg 的混合溶液。
- 为麻醉小鼠，按每 10 g 体重注射 100 μl 的剂量将药物注入腹腔。
- 将麻醉后的小鼠放入成像盒中。放置小鼠时需特别注意，确保目标解剖区域与相机成像平面保持平行。
- 将装有小鼠的成像盒放入 IVIS 系统，并以 0.5 L/min 的流速通入异氟烷，以维持麻醉状态。
- 将 IVIS 仪器设置为正确的成像平台和 binning 模式，采集持续 7 分钟的图像。
- 在将小鼠放回饲养笼之前，将其置于加温的恢复箱中（例如使用加热垫）使其从麻醉中恢复。
- 使用 Living Image 软件包 3.0 版本（Caliper Life Sciences）对图像进行分析，并调整至相同尺度。
- 可对选定的兴趣区域内的生物发光信号进行定量分析，结果可表示为总通量（photon/s）或平均辐射通量（photons/s/cm2/sr）。
5. 组织样本处理以测定细菌载量和病毒滴度
- 采用 CO2 窒息法处死小鼠，并使用 70% 乙醇对毛发进行消毒。
- 将动物固定在硬质切板上。
- 使用无菌手术刀片从后部开始，沿动物头部中线切开，并将头部两侧向外弯曲以暴露鼻咽部。
- 使用无菌镊子刮取每侧头部的鼻咽组织，收集至 1.5 mL 冰冷的 RPMI 培养基中，置于冰上保存。
- 使用剪刀打开胸腔，用无菌镊子和剪刀取出肺组织。用 PBS 冲洗肺组织三次以去除血液，随后收集至 1.5 mL 冰冷的 RPMI 培养基中，置于冰上保存。
- 使用匀浆器对组织进行匀浆处理，然后放回冰上。
- 取部分匀浆后的组织用于测定细菌载量。对组织匀浆液进行系列稀释后涂布于 HBA 培养基上。在 37°C 培养 18–24 小时，测定活菌数。特定器官中的细菌滴度可与该区域观察到的光子数进行关联分析。
- 将剩余匀浆组织在 4°C 条件下以 3,500 rpm 离心 10 分钟。收集上清液并转移至洁净无菌管中。将上清液储存于 -70°C，并通过蚀斑实验测定病毒滴度。
6. 通过蚀斑实验测定组织匀浆中甲型流感病毒滴度
- 通过在Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞融合单层上形成蚀斑来测定病毒的感染滴度。MDCK细胞常规在RF10培养基（表1）中，于组织培养瓶（Nunc）内培养，并在细胞融合后进行传代。
- 使用胰蛋白酶从组织培养瓶中消化并分离MDCK细胞。用RF10洗涤细胞，并在1200 rpm下离心5分钟收集细胞。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于RF10培养基中。使用血细胞计数板和活体染料对MDCK细胞进行计数。在每个6孔板（Nunc）的35 mm孔中接种1.2×106个MDCK细胞，加入3 mL RF10培养基，在37°C、5% CO2条件下培养约24小时，直至形成融合单层。
- 配制Leibovitz dsL15培养基和1.8%（w/v）琼脂糖覆盖培养基（表1）。将dsL15培养基和1.8%（w/v）琼脂糖分别分装至无菌瓶中，每瓶50 mL。dsL15培养基保存于4°C备用，琼脂糖保存于56°C备用。
- 检查MDCK细胞单层是否已融合，通过抽吸去除RF10培养基，并用约1.5 mL RPMI+洗涤细胞。操作过程中切勿使培养板干燥。将培养板置于37°C环境中，待接种含病毒样品时使用。
- 用RPMI+对病毒样品进行系列稀释。稀释后的样品置于冰上保存，直至使用。
- 抽吸去除单层细胞上的RPMI+，向每孔加入135 µL适当稀释度的病毒样品。每个样品设两个重复孔。
- 将MDCK细胞与病毒样品在37°C、5% CO2条件下共同孵育45分钟。每隔15分钟轻轻摇动培养板，使病毒均匀分布，并防止MDCK细胞单层干燥。
- 将琼脂糖从56°C转移至46°C水浴，同时将dsL15培养基预热至46°C水浴中。
- 病毒在MDCK单层上孵育45分钟后，将培养板从5% CO2培养箱中取出。将琼脂糖和L15培养基从46°C水浴中取出。向50 mL dsL15培养基中加入0.2 mL 0.1%胰蛋白酶，混匀后将50 mL dsL15+胰蛋白酶加入50 mL 1.8%（w/v）琼脂糖中。轻轻混合琼脂糖与L15培养基，向6孔板的每孔加入3 mL覆盖培养基。轻轻旋转培养板，确保MDCK细胞单层完全被覆盖。待覆盖层凝固后，将培养板置于37°C、5% CO2条件下孵育2–4天。
- 孵育结束后，通过计数蚀斑数量来评估病毒的感染性。如有需要，可通过甲醇溶解的结晶紫对单层细胞染色，以清晰观察蚀斑。
7. 第 C 节 - 成功的关键：
1 所有涉及S. pneumoniae的实验操作（例如，接种液体培养物、处理感染S. pneumoniae小鼠的组织）均在II级生物安全柜中进行。
1.1 我们构建生物发光的 S. pneumoniae 通过引入质粒 pPJTG28 对菌株进行改造 3. 然而，存在多种不同的生物发光 S. pneumoniae 菌株可在 4-6 天内获得。生物发光 S. pneumoniae 菌株也可从 Caliper Life Sciences Inc（MA，美国）购买。
1.1 不同 S. pneumoniae 菌株的生长动力学可能存在差异，应针对每种菌株分别测定。达到 OD600nm=0.4 至 0.45 可能需要 3 到 4 小时。
1.4 我们通常预期感染性菌液的浓度达到 10e8 CFU/ml，建议进行 10e-4 至 10e-8 的稀释梯度，以确定活菌浓度。
2.6 接种鸡蛋所用的合适滴度取决于所使用的病毒株，可能在 10e-3 至 10e-5 之间。从组织培养上清中获得的甲型流感病毒株有时可直接使用原液。
3.2a 我们常规使用 2,000 CFU 的 S. pneumoniae 菌株 EF3030 感染 5 日龄小鼠3。每次实验所用接种物的精确感染剂量，均通过将接种物进行系列稀释后接种至马血琼脂平板，经培养后回溯确定。在接种小鼠后的多个时间点，通过组织匀浆（例如鼻咽部、肺组织）的活菌计数，首先评估该 S. pneumoniae 菌株在小鼠体内的定植能力。
3.2b 通过吸入途径向动物施用细菌或病毒时，无需使用麻醉剂。应由实验人员用手固定幼鼠（以及成年鼠）并使其保持直立姿势，然后将接种物（幼鼠为 3 µL，成年鼠最多 10 µL）滴入鼻孔，并通过观察确认动物已将全部接种物吸入。
3.2c 逐只将新生小鼠从窝中取出，根据需要接种细菌或病毒。如有必要，用永久性记号笔标记动物尾部，并立即将动物放回笼中。用一些垫料擦拭动物，以便母鼠能重新接受幼仔回到窝中。注意：永久性记号笔在动物体表很快会褪色，需每天重新标记。也可使用纹身标记系统来识别个体动物。
3.3 使用20 PFU流感病毒A/Udorn/307/72（H3N2）感染8至14日龄小鼠3。动物中观察到的死亡率和发病率将取决于病毒毒株 S. pneumoniae 以及所使用的甲型流感病毒。表3提供了适用于21日龄以下小鼠的一组实用的人道终点和干预标准。在使用这些条件时，我们通常未观察到任何死亡率或发病情况。 S. pneumoniae EF3030 与流感病毒 A 型 Udorn/307/72（H3N2）株在小鼠中 >10 天大
4.2 为确保准确性，可在注射麻醉剂溶液前对小鼠进行称重。作为参考，20日龄小鼠大约使用50–75 µL麻醉剂溶液。当小鼠对尾部或后肢的夹捏刺激无反应时，表明已完全麻醉。在IVIS成像过程中，小鼠还将暴露于异氟烷，以维持麻醉状态。感染小鼠后进行成像的时间取决于所使用的肺炎链球菌（S. pneumoniae）和甲型流感病毒的菌株/毒株类型以及所关注的症状表现。可能需要开展若干次预实验，以优化生物发光成像的时间点。
4.3 可将小鼠放入隔离箱（可防止污染物进入或离开箱体）中，也可直接将其放入仪器中进行成像。对于幼鼠实验，我们使用隔离箱，以确保小鼠在成像过程中保持麻醉状态，并防止肺炎链球菌（S. pneumoniae）和/或甲型流感病毒污染IVIS系统。
4.3 使用小鼠的腹侧图像获取呼吸道图像。小鼠的侧位图像可提供更为敏感的耳部图像。
4.4 将小鼠直接放入舱内时，通过鼻罩向小鼠输送异氟烷。对于使用幼鼠的实验，建议使用隔离箱，因为鼻罩不适用于幼鼠。
4.5 捕获图像所需的总曝光时间可能因实验而异，具体取决于生物发光信号的强度、信号位置、所用细菌菌株和小鼠菌株。就后者而言，小鼠的色素和毛发均可显著减弱可检测到的总信号。IVIS Spectrum 上的相机为背照式薄化 CCD，具有宽动态范围（65536 灰度级）。理想情况下，曝光时间应设置为捕获 60 至 60,000 计数之间的信号。根据我们使用 C57BL/6 小鼠的经验，将成像时间延长至 7 分钟以上并不会显著改善信噪比。增强生物发光信号的其他可选方法包括提高 binning 程度（例如设为“大”）以及使用更小的视野。重要的是，不应在图像内包含饱和像素的区域进行定量分析，因为这会导致检测到的光子数被低估。如果不确定最佳条件，可使用自动曝光功能作为参考指南。
4.5 如果小鼠某一部位的强生物发光信号干扰了邻近区域生物发光的检测，可用黑纸覆盖小鼠的选定区域，然后正常进行成像
4.7 如果以光子数（而非计数值）对发光信号进行定量，则实验之间成像条件（例如成像时间）的变化不会影响生物发光信号的测量结果。
4.8 若使用总通量来测量特定区域内的光子数，请确保所有样品均采用相同形状的“感兴趣区域”。
5.1a 小鼠可在感染甲型流感病毒后的任意时间点实施安乐死，具体时间取决于研究人员的研究目的。我们通常在感染甲型流感病毒 Udorn/307/72 (H3N2) 后第6天测定细菌和病毒滴度，此条件下一般未观察到死亡或发病现象。然而，实验中观察到的发病和死亡情况会因使用的肺炎链球菌（S. pneumoniae）和甲型流感病毒毒株的不同而有所差异，因此选择时间点时应考虑死亡率和发病率，以尽量减少对动物福利的影响。表3为实验中干预标准和人道终点的使用提供了实用指导。通常情况下，小鼠在安乐死后3小时内进行组织处理 体内 生物发光成像
出生不足10天的小鼠对缺氧具有抗性，可通过断头法实施安乐死。在所述实验条件下，小鼠至少为14日龄，可采用CO2窒息法实施安乐死。
5.7 可在血琼脂平板中添加 5μg/ml 的庆大霉素，以抑制鼻腔组织匀浆中共生细菌的生长。S. pneumoniae 菌株的不同将影响稀释范围的选择。在使用 S. pneumoniae 菌株 EF3030 对 20 日龄小鼠进行的实验中，我们采用原液、10e-1、10e-2 和 10e-3 的稀释度。
5.8 将每份匀浆组织样本至少分装成两份，以便在病毒蚀斑实验失败时有备用样本！准确的病毒滴度只能从冻存后仅冻融一次的样本中获得，而不能从反复冻融的样本中获得。
6.1 当生长至90-100%融合时，一个150 cm2的组织培养瓶可获得足够用于五个6孔板的MDCK细胞。
6.5 最佳的系列稀释倍数取决于所使用的病毒株及感染后时间。通常，在甲型流感病毒感染后第6天采集的器官匀浆样本，我们会使用原液、10⁻¹ 和 10⁻² 的稀释度。
6.6 使用病毒储备液的系列稀释液作为每次蚀斑试验的适当阳性对照。阴性对照可使用RPMI+。
8. 代表性结果：
图 1. 鸡胚蛋的示意图。
图2. 流感病毒假感染后第3天和第4天，S. pneumoniae 感染小鼠的生物发光成像（BLI）。
图3. 流感病毒感染后第3天和第4天，S. pneumoniae 与流感病毒共感染小鼠的生物发光成像（BLI）。
图 4. 单一感染与共感染小鼠鼻腔中的细菌载量。
图 5. 共感染小鼠鼻腔和肺部的病毒滴度。
| 媒体 | 目录 |
| 1.8% (w/v) 琼脂糖 | 将 0.9 克琼脂糖加入 50 mL 蒸馏 H2O，通过高压灭菌在 121°C 10分钟。转移至 56°C 水浴冷却。 |
| 双倍浓度 Leibovitz L15 培养基（ds L15） | 1 袋 L15 粉末（用于配制 1 L）溶于 450 mL 无菌蒸馏 H₂O 中2O，并搅拌至溶解。用1 M HCl调节pH至6.8。然后加入4 mL 7%（w/v）NaHCO3、0.4 mL HEPES（0.5 M，pH 6.8）、200 U/mL青霉素， 200 μg/ml 链霉素, 60 μg/ml 庆大霉素。调节终体积至500 mL，并过滤除菌。 |
| 马血琼脂（HBA） | 4% HBA（Oxoid，Basingstoke，英国），dH2O型，7%（体积/体积）马血 |
| RF10 | 含 2 mM 谷氨酰胺、2 mM 丙酮酸钠的 RPMI-1640 24 μg/ml 庆大霉素，100 U/ml 青霉素， 100 μg/ml 链霉素，10% (v/v) 热灭活胎牛血清 |
| RPMI+ | 含 2 mM 谷氨酰胺、2 nM 丙酮酸钠的 RPMI-1640 24 μg/ml 庆大霉素，100 U/ml 青霉素， 100 μg/ml 链霉素 |
| Todd-Hewitt 肉汤 + 0.5% 酵母提取物 | Todd Hewitt 肉汤（Oxoid，Basingstoke，英国）在 dH2O，添加2%（w/v）酵母提取物 |
表1. 本方案中使用的特定培养基。
| 材料名称 | 类型 | 公司 | 目录号 | 备注 |
| RPMI medium 1640 | 试剂 | Gibco | 21870-076 | |
| 胰蛋白酶 | 试剂 | Worthington Biochemical Corporation | LS003740 | 经TPCK处理 |
| Leibovitz's L-15 培养基 | 试剂 | Gibco | 41300-039 | |
| 琼脂糖，I型 | 试剂 | Sigma-Aldrich | A6013 | 使用低熔点琼脂糖，例如 SeaPlaque 琼脂糖 |
| Madin-Darby Canine Kidney 细胞 | 试剂 | ATCC | CCL-34 |
表2. 特定试剂与设备：
| 对动物福利的影响 | ||
| 轻度至中度体征a | 严重症状b | |
| 非特异性体征： | ||
| 外观 | 轻度至中度毛发竖立，无脱水（皮肤 tents） | 竖毛，伴脱水（皮肤 tents 征） |
| 身体状况 | 体重增长减缓 | 无体重增加或体重减轻 |
| 行为 | 反应减弱但仍有应答，与同伴互动减少。 | 对刺激和挑逗无反应，与其他同窝幼崽隔离 |
| 特定条件或异常临床体征： | ||
| 无乳斑 (<2-3天大 | 如果已观察到这种情况，应尽量鼓励吮吸 <24小时。 | 若经刺激后24-48小时内仍无哺乳迹象，或明显未进行哺乳，应考虑实施安乐死。 |
| 其他体征 | 咨询动物设施管理员/实验动物兽医的意见，以确定适当处理措施；若动物处于中度或重度疼痛或痛苦状态，应实施安乐死 | |
表3. 婴儿小鼠（<21日龄）的干预标准：
a 当观察到一种或多种“轻度至中度”症状时，应将观察频率增加至每日两次，并在必要时咨询动物福利官员，以便及时给予治疗和护理。
b 当观察到一个或多个“严重”体征时，采用适当方法对小鼠实施安乐死。小鼠 < 10日龄小鼠通过断头法实施安乐死 > 10日龄小鼠通过CO₂安乐死2 窒息
讨论
体内成像技术结合IVIS成像系统是一种独特的方法，可实现对微生物致病过程的实时可视化4, 6-9。本文展示了该技术在研究婴儿小鼠中S. pneumoniae与流感病毒协同作用方面的应用。由于该技术具有非侵入性，我们能够长期动态监测每只小鼠个体感染的进展过程。这使我们能够记录共同饲养的婴儿小鼠之间肺炎链球菌传播的动力学特征3。该技术的非侵入性特点使研究人员能够在每个实验中使用更少的动物，从而减少动物使用量。此外，还可利用IVIS成像系统观察感染扩散至体内此前未知的感染部位，以及通过解剖难以取样的部位（如中耳）。
在开始成像实验之前，我们通过测定组织匀浆中的活菌数量，确认了生物发光EF3030菌株的定植水平与亲本EF3030菌株相当。此外，我们首先证实，与亲本EF3030菌株的结果一致（结果未显示），流感病毒感染会导致定植动物鼻咽部生物发光EF3030菌株的载量增加。
尽管IVIS技术操作简便，且能产生可重复且易于理解的数据，但实验设计必须严谨，以最大限度地提高该技术的灵敏度和实用性。例如，IVIS相机的灵敏度会受到组织深度和不透光性的影响。 8这在我们的经验中会提高源自肺部的生物发光信号的检测限。此外，深色毛发和色素沉着的皮肤会使光透射降低多达10倍（相较于无毛小鼠） 8在开发该方法的过程中，我们已优化本方案以适用于5至14日龄的C57BL/6小鼠，并已证实IVIS可用于检测生物发光标记的病原体在20日龄C57BL/6小鼠中的定植情况 S. pneumoniae EF3030。然而，在裸鼠或BALB/c小鼠中进行这些实验时，信号检测灵敏度可能会提高。尽管如此，IVIS相机仍代表了一种新颖的方法，可用于监测、表征并最终理解 体内 流感病毒感染后肺炎链球菌病的发病机制
披露
本视频文章的制作由Caliper Life Sciences赞助。
致谢
作者感谢美国阿拉巴马大学伯明翰分校的大卫·布赖尔斯（David Briles）提供的技术建议。我们还要感谢墨尔本大学动物福利官陈玉婷（Yvette Chen）和动物设施经理大卫·泰勒（David Taylor），感谢他们在动物福利与伦理方面，以及针对本论文所述实验的干预标准和人道终点的制定过程中提供的有益建议和讨论。
Odilia Wijburg 和 Patrick Reading 获得 NHMRC R.D. Wright 奖学金的支持，Kirsty Short 获得 GSK 研究生资助和 Puzey 奖学金的支持。
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