甲病毒转导系统：蚊媒感染可视化工具

摘要

本文描述了利用甲病毒转导系统在体外及成年蚊子中表达荧光报告蛋白的方法。该技术可被改造用于表达任何目标蛋白，以替代或同时与报告蛋白共同表达。

摘要

甲病毒转导系统（ATSs）是在感染过程中表达目的基因（GOI）的重要工具。ATSs来源于蚊媒RNA病毒的cDNA克隆（属Alphavirus，科Togaviridae）。Alphavirus属包含约30种不同的蚊媒病毒物种。甲病毒为有包膜病毒，含有单股RNA基因组（约11.7 Kb）。甲病毒可转录一条亚基因组mRNA，编码病毒结构蛋白，这些蛋白是基因组衣壳化和病毒成熟所必需的。甲病毒在脊椎动物细胞中通常具有高度裂解性，但在易感蚊虫细胞中可建立持续感染，且细胞病变作用极小。这些特性使其成为在蚊媒昆虫中进行基因表达的优良工具。目前最常用的ATSs来源于辛德比斯病毒（SINV）。SINV具有广泛的宿主物种嗜性，可感染昆虫、鸟类和哺乳动物细胞^9,10,20。然而，其他甲病毒也已被开发为ATSs。通过插入额外的病毒亚基因组RNA起始位点或启动子，可实现外源基因的表达。将外源基因序列置于病毒结构基因5'端的ATSs，可用于在昆虫中稳定表达蛋白质；而将基因序列置于结构基因3'端的ATSs，则可用于触发RNA干扰（RNAi），从而沉默该基因在昆虫中的表达。

ATSs 已被证明是研究媒介-病原体相互作用、病毒复制的分子机制以及维持感染周期的宝贵工具^3,4,11,19,21。特别是，荧光和生物发光报告基因的表达在追踪媒介中的病毒感染及病毒传播方面发挥了关键作用^5,14-16,18。此外，已有研究利用两种经基因工程改造后表达 GFP 的 SINV 毒株来描述媒介的免疫反应^2,9。

本文介绍了一种利用携带荧光报告基因（GFP）的cDNA感染性克隆制备SINV的方法。将线性化的cDNA克隆作为模板，体外转录生成具有感染性的全长RNA。通过电穿孔法将具有感染性的RNA导入易感的靶细胞中。转染后的细胞可产生表达目的基因（GOI）的感染性病毒颗粒。收获的病毒可用于感染蚊虫（如本文所述）或其他宿主物种（本文未展示）。通过检测中肠以外部位的荧光信号或监测病毒传播情况来评估媒介传播能力⁷。使用荧光报告基因作为目的基因，可方便地估测病毒在细胞培养物中的扩散范围，确定感染速率、暴露蚊虫体内的病毒扩散情况以及蚊虫的病毒传播能力，同时为媒介传播能力提供快速的评估指标。

方案

以下方案是针对基于辛德比斯病毒MRE16的自主型病毒系统（ATS）的制备与使用而编写。该ATS旨在使蚊媒传播载体埃及伊蚊（Aedes aegypti）表达绿色荧光蛋白（GFP）。目前已有多种甲病毒（如辛德比斯病毒、基孔肯雅病毒、O'nyong-nyong病毒、西方马脑炎病毒）的cDNA感染性克隆，这些克隆已被设计为ATS（见表1）。为获得最佳效果，建议使用如SURE感受态细菌（Stratagene/Agilent Technologies）等宿主菌扩增质粒DNA，以避免发生非预期的重组或病毒cDNA丢失。所有感染性克隆质粒在其病毒cDNA的5'端紧邻处均含有一个噬菌体T7或SP6启动子，用于全长基因组RNA的转录，同时在3'端含有一种独特的限制性内切酶位点，用于截断式转录。针对每种ATS，使用者必须选用相应的噬菌体DNA依赖性RNA聚合酶及独特的限制性内切酶，以实现病毒RNA基因组的体外（in vitro）转录。

1. 从cDNA克隆生成具有感染性的RNA。

1. 在100 μL反应体系中，使用20单位的XhoI限制性内切酶对5 μg的感染性克隆质粒（p5'dsMRE16/GFP）进行线性化处理。在37°C下孵育2–3小时。
2. 使用Qiagen QIAprep Spin Miniprep试剂盒的替代纯化方案纯化线性化DNA，用50 μL无RNase的水从离心柱中洗脱DNA。质粒浓度应约为1.0 μg/μL。
3. 在无RNase的0.2 mL PCR管中，按照Ambion MAXIscript试剂盒的操作说明，配制50 μL的体外转录反应体系，如下所示：
   
   • 22.5 μL 无RNase的dH₂O
     • 5.0 μL 线性化DNA模板（1.0 μg/μL）
     • 2.5 μL 10 mM ATP
     • 2.5 μL 10 mM CTP
     • 2.5 μL 10 mM UTP
     • 2.5 μL 1 mM GTP
     • 2.5 μL 10 mM 帽类似物（m⁷G(5')ppp(5')G）
     • 5.0 μL 10×转录缓冲液
     • 5.0 μL T7或SP6聚合酶混合液
   • 总体积 50.0 μL
4. 将转录反应在37°C孵育1小时。孵育结束后，应立即用于BHK-21细胞的电穿孔转染。在转录反应孵育期间，应开始准备用于电穿孔的BHK-21细胞。

2. 从感染性RNA生成病毒

1. 每份 ATS 取两瓶 70-80% 汇合度的 150 cm²（T-150）培养瓶 BHK-21 细胞，用胰蛋白酶消化。
2. 将所有细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
3. 在常规台式离心机中，以 2000 rpm、4°C 离心 10 分钟，使细胞沉淀。
4. 用不含 Mg++ 和 Ca++ 的无菌 PBS 重悬细胞。重复步骤 2.3 和 2.4，直至细胞用 PBS 洗涤三次。
5. 将沉淀的细胞重悬于 0.5 mL 含 10% FBS 的 MEM 培养基中。
6. 取 10 μL 细胞与 90 μL 含 10% FBS 的 MEM 混合稀释，用血细胞计数板计数。必要时，用含 10% FBS 的 MEM 将细胞稀释至 2.5–12.5 × 10⁷ 个细胞/mL。
7. 向预冷的 0.2 cm 电穿孔比色皿中加入 400 μL 细胞悬液和 20 μL 转录反应液。擦去比色皿表面的冷凝水。
8. 对比色皿进行两次电脉冲：450 V，1200 Ω，150 μF。我们使用 Harvard Apparatus 公司的 Electro Cell Manipulator 型号 ECM630。
9. 将比色皿中的全部内容物转移至含 5 mL 含 10% FBS 的 MEM 培养基的 25 cm² 组织培养瓶中。
10. 将培养瓶置于 37°C、5% CO₂ 条件下培养。
11. 使用配备合适滤光片组的倒置荧光显微镜每日观察感染情况（例如 GFP 滤光片：激发波长 = 460–490 nm，发射波长 = 510–550 nm；或 dsRed 滤光片：激发波长 = 460–560 nm，发射波长 = >590 nm）。
12. 当荧光显示感染已完全覆盖或整个培养瓶中可见细胞病变效应（CPE）时，收集培养瓶中的内容物，加入 30% FBS，按需分装，并于 -80°C 保存。如需要，可在加入 FBS 前通过离心（2000 rpm，10 分钟，4°C）去除细胞裂解物中的不溶物。
13. 将病毒至少传代一次至新的细胞培养瓶中，以提高后续血液饲喂实验所需的病毒滴度。

3. 口服 蚊虫感染

1. 将血液（通常为购买的去纤维蛋白羊血）与第2.13步获得的细胞培养病毒悬液混合。血液餐中的最终病毒滴度通常应约为~1x10⁷ 斑块形成单位（pfu）/mL，用于高效感染蚊虫中肠。为刺激蚊虫充分吸血，可加入腺苷5'-三磷酸（ATP），使其终浓度达到0.02 M。
2. 在感染前，可能需要对蚊虫进行脱水和脱糖处理，以促进其通过人工饲喂装置高效地吸食血液。剥夺时间应预先确定，以尽量降低死亡率。具体时长取决于蚊种、昆虫饲养室的湿度等因素。作为起始方案，可在饲喂前24小时移除糖源，12小时移除水源。本实验方案采用带水套的玻璃饲喂器17，其内循环 37°C 水。将猪肠膜（即大多数杂货店可购得的彻底清洗过的香肠套膜）覆盖在饲食器口部，然后用移液器将食物加入腔室中。针对不同载体类型，可采用多种设计、膜材料和操作方案。
3. 将蚊子进行分拣，仅选取吸血饱食的个体。将饱血蚊子转移至顶部覆盖纱布的纸箱中，并在以下条件下孵育： 28°C，75-80% 相对湿度条件下培养至进行 GFP 表达检测。

4. 蚊虫胸腔内接种

胸腔内接种是感染节肢动物的一种替代方法。当无需通过中肠进行病原体扩散时，可采用此方法。（下文描述了该方法，但本视觉实验中未展示该技术操作过程）。

1. 从饲养笼中用吸管吸取少量蚊虫（5–10只），转移至塑料储存管中。将密封的储存管置于4°C环境中15分钟，以使蚊虫麻醉。
2. 将25只蚊虫从管中倾倒至置于冰上的玻璃培养皿中。不使用时或蚊虫开始活动时，应盖上培养皿盖子。操作蚊虫过程中，必须小心计数并记录所操作的蚊虫数量。当蚊虫被倾倒至低温操作台时，需在实验记录本上记录总数。
3. 使用Nanoject专用玻璃毛细管和拉针仪，通过熔融法制备注射针头。
4. 按照制造商说明设置Nanoject II微量注射仪，使其注射69 nL的接种物。吸取接种物时需格外小心，避免损坏针头。
5. 在解剖显微镜下，将针头插入蚊虫胸部，并启动Nanoject进行接种。接种时应谨慎操作，避免针头完全穿透蚊虫体壁导致其死亡。每次接种后，在将蚊虫从针头取下前，应确认接种物已成功注入。
6. 接种完成后，蚊虫仍穿刺在针头上时，应通过纸制储存盒侧面的小孔将其放入盒内，小孔在非操作时需用棉团或软木塞封堵。
7. 当蚊虫全部接种并放入储存盒后（每盒最多约50只），应小心用胶带固定软木塞，防止蚊虫意外逃逸。随后将储存盒放入安全的饲养容器中，转移至昆虫饲养室，在28°C、80%相对湿度条件下继续培养。

5. 监测蚊虫感染

1. 将装有蚊子的纸盒置于 4°C 环境中约 15 分钟，以 immobilize（固定）蚊子。
2. 将少量蚊子（每次 5–10 只）转移至适配荧光显微镜使用的冰冻台。
3. 根据是否存在荧光对蚊子进行观察和分类。此外，荧光强度可作为感染程度的半定量指标。可解剖蚊子组织（如中肠、唾液腺、脂肪体）并检测其荧光信号。
4. 如条件允许，可将筛选后的蚊子放回纸盒，继续培养感染蚊子。

6. 传播实验（通过强制唾液分泌证明病毒传播）

1. 在喂食前 24 小时内剥夺蚊虫的糖源。
2. 去除蚊虫的足和翅膀。
3. 向一端经加热、拉伸并剪切的 50 μL 毛细管中加入 3–5 μL Cargille B 型浸油或含 10% 血清的蔗糖溶液。
4. 将蚊虫的喙器插入毛细管中。若使用浸油，可见唾液从喙器渗出形成液滴。可在胸部施加 1 μL 含 1% 毛果芸香碱的 PBS 溶液（含 0.1% Tween 80）以促进分泌。
5. 60–90 分钟后，取出蚊虫，必要时保存用于病毒分离。
6. 通过离心将毛细管中的液体转移至含有 100 μL 20% FBS-PBS 的管中。
7. 将接种物经 0.2 μm 注射器滤器无菌过滤，然后使用滤过的接种物感染培养细胞。

生物安全说明：本方案描述了一种用于产生、鉴定和监测感染蚊虫的方法。根据您所在机构的条件（例如冷台、 containment facility 等）以及机构生物安全委员会（IBC）的批准，您可能仅被允许在去除蚊子的翅膀和足部后进行观察，以防止其逃逸。基于SINV的反向遗传系统（ATS）可在BSL2环境中生成和使用。而使用基于其他甲病毒（如基孔肯雅病毒或西方马脑炎病毒）的反向遗传系统（ATS）则需要在BSL3设施中进行。

7. 代表性结果

图1展示了使用ATS 5'dsMRE16/GFP表达报告基因（GFP）的总体情况。图2显示了BHK-21细胞和C6/36细胞（Aedes albopictus）在以0.01感染复数感染5'dsMRE16/GFP病毒后特定时间点的GFP表达情况。图3概述了当病毒通过感染性血餐递送时，甲病毒和ATS病毒在蚊子体内的感染过程。图4展示了含有约10⁷ pfu/mL ATS病毒的血餐制备过程，随后对埃及伊蚊（Aedes aegypti）进行口服感染。图5利用落射荧光显微镜观察感染后10天的整只蚊体及其特定部位的全身视图。图6显示了感染表达各自荧光报告基因的ATS 5'dsMRE16病毒后，在感染蚊虫中肠内检测GFP和dsRED的情况。图7为使用感染了5'dsMRE16/GFP ATS病毒的蚊子进行的传播能力检测实验。

表1. 目前为蚊子基因表达而设计的ATS系统。

甲病毒	ATS	蚊虫	参考文献
辛德毕斯病毒	TE/3'2J 和 TE/5'2J	Aedes aegypti	12
		Ochlerotatus triseriatus	13
	3'dsMRE16 和 5'dsMRE16	A. aegypti	5
		Culex tritaeniorhynchus	5
	5'dsTR339	A. aegypti	2
基孔肯雅病毒	3'dsCHIKV 和 5'dsCHIKV	A. aegypti/A. albopictus	20
奥尼翁尼翁病毒	5'dsONNV	Anopheles gambiae	1,9
西方马脑炎病毒	5'dsWEEV.McMillan	Culex tarsalis	Stauft et al., 未发表

表2. 使用ATS进行蚊子基因表达的优缺点。

优点：

快速产生高滴度病毒

宿主范围广（SINV）

RNA 复制速率高

外源基因表达水平高

基因操作相对简便

在昆虫中可实现稳定、持久的基因表达

在昆虫中引起的病理变化极小

缺点：

在脊椎动物细胞中为短期表达模式

对脊椎动物细胞具有强烈的细胞病变效应

基因大小受限（理想情况下 <1Kb）

某些甲病毒需要在 BSL3 级别 containment 中操作

图1： 使用表达GFP的p5'dsMRE/GFP SINV在BHK-21细胞中进行ATS病毒生产的概述。随后 体外 转录，基因组ATS RNA通过电穿孔导入BHK-21细胞以拯救病毒。拯救出的ATS病毒可用于感染蚊子。SGP = 亚基因组启动子。细胞内转录出三种ATS RNA：基因组RNA、亚基因组1 RNA和亚基因组2 RNA。C（衣壳蛋白）、E2和E1糖蛋白与ATS基因组合并，形成具有感染性的病毒。

图2： 墨西哥克里塔瓦病毒（SINV）5'dsMRE16/GFP病毒感染后，蚊子（C6/36）细胞中GFP的表达。

图3：蚊子感染ATS病毒并导致病毒传播的总体过程。

图 4： 通过让蚊子接触具有感染性的血液餐，实现 ATS SINV 5'dsMRE16 感染。

图 5： 感染后第10天的ATS SINV 5'dsMRE16/GFP感染。全虫GFP检测显示病毒已逃逸中肠并扩散至继发性组织。该图还显示选定虫体部位中的GFP表达，提示存在弥散性感染。

图6： ATS SINV 5'dsMRE16/GFP 和 5'dsMRE16/dsRED 在感染后特定时间对中肠的感染。通常在摄入含病毒血餐后早期，中肠会出现明显的感染灶，随后感染逐渐扩散至整个后中肠。

图7：在感染后8天即可在蚊子唾液中检测到ATS 5'dsMRE16/GFP。该检测旨在展示ATS病毒的传播能力，结果表明5'dsMRE16/GFP病毒在整个蚊媒外潜伏期中能够稳定表达GFP。左图显示蚊子向毛细管中分泌唾液，中图和右图分别显示接种唾液后1天和3天的C6/36细胞感染情况。

讨论

本文所述方法使研究人员能够追踪甲病毒在蚊子细胞培养物及成年雌性蚊子中的感染过程。使用甲病毒转导系统（ATS）病毒的优缺点已在表2中总结。ATS感染性克隆可通过遗传操作表达任意目的基因（GOI），已被用于表达单链抗体、RNA干扰抑制因子、靶向内源基因的反义RNA以及促凋亡蛋白。若未使用报告基因，则本方法中的成像部分不适用。然而，ATS病毒的拯救、扩增及蚊子感染仍需采用许多相同的实验方案。将外源基因插入甲病毒转导系统时，其最大尺寸存在一定的限制。尺寸限制因构建ATS所用亲本毒株的不同而有所差异，通常约为1 kb，但已有研究在蚊子用ATS构建中成功使用了如萤火虫荧光素酶等较大的报告基因。具备基本病毒学背景的研究实验室应能根据这些方案应用ATS系统，目前已有多个研究实验室成功使用基于SINV的ATS系统开展研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
QIAprep 旋转式质粒小提试剂盒	Qiagen	27104
MAXIscript 体外转录试剂盒	Ambion	AB1312	务必使用含有适用于您构建体的适当聚合酶的试剂盒。
加帽类似物（m7G(5’)ppp(5’)G）	Ambion	AM8050
Nanoject II 纳升注射仪	Drummond Scientific	3-000-204
电穿孔细胞操作仪	Harvard Apparatus	ECM 630