一种用于记录遗传标记视网膜神经节细胞光反应的离体视网膜制备方法

摘要

本文介绍了如何对小鼠离体视网膜进行解剖和记录。具体而言，我们描述了如何记录荧光标记的视网膜神经节细胞群体对光刺激的反应，并进一步识别和分析其形态学特征。

摘要

脊椎动物视觉的最初步骤发生在光刺激视网膜的视杆细胞和视锥细胞时¹。随后，这些信息被分为所谓的“ON通路”和“OFF通路”。光感受器将光信号传递给双极细胞（BCs），这些细胞在光强度增加（ON BCs）或减少（OFF BCs）时发生去极化。这种光信息的分离在视网膜神经节细胞（RGCs）层面得以维持，RGCs的树突分别在内丛状层（IPL）的OFF亚层中分层，直接接收来自OFF BCs的兴奋性输入，或在IPL的ON亚层中分层，直接接收来自ON BCs的兴奋性输入。关于光照增强或减弱的信息分离（即ON和OFF通路）被保守地并行传递至大脑。

视网膜神经节细胞（RGCs）是视网膜的输出细胞，因此研究这些细胞对于理解光信号如何传递至脑内视觉核团具有重要意义。近年来，小鼠遗传学的进展已催生出多种荧光报告小鼠品系，其中特定的RGC群体被荧光蛋白标记，从而可识别RGC亚型^{2 3 4}，并实现电生理记录中的特异性靶向。本文介绍一种在完整、离体的视网膜制备标本中记录荧光标记神经节细胞光反应的方法。该离体视网膜制备标本可保留RGC的树突分支结构及其整个树突域上的输入连接，从而实现对RGC的记录。该方法适用于多种神经节细胞亚型，并可与多种单细胞生理学技术结合使用。

方案

动物使用声明： 动物的饲养和管理遵循所述指南中的规定 实验动物护理和使用指南，采用明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会批准的方案。

1）溶液的配制

1. 在进行电生理记录之前，需要配制细胞内液、细胞外液和酶溶液。
2. 细胞外液：将一瓶（8.8 g）粉末状Ames培养基（Sigma）与1 L H₂O和1.9 g碳酸氢钠（23 mM）混合。在整个操作过程中，细胞外液需持续用95% O₂/5% CO₂混合气体饱和。取200 mL转移至烧杯中用于视网膜保存。将剩余溶液放入灌流系统的容器中，待视网膜安装后用于重力灌流。
3. 细胞内液：细胞内液应预先配制，并分装为500–1000 μL的等分试样，于-20 °C保存。细胞内液的配方根据实验需求有所不同；本实验中用于电流钳记录的配方（单位为mM）如下：125 K-葡萄糖酸盐、2 CaCl₂、2 MgCl₂、10 EGTA、10 HEPES、2 Na₂-ATP、0.5 NaGTP，用KOH调节pH至7.2⁵。可加入10 μM Alexafluor-594 肼（Invitrogen）等荧光示踪剂以在实验过程中观察树突形态，也可加入0.3%神经生物素（neurobiotin）以便记录后对细胞形态进行分析。准备记录时，将细胞内液解冻。
4. 酶溶液：将10000单位胶原酶（Worthington Chemicals）与83 mg透明质酸酶（Worthington Chemicals）溶于4.150 mL细胞外液中。分装为50 μL等分试样，于-20 °C保存。分装样品可在数周内使用。处理视网膜前，将一份等分试样稀释于500 μL通入混合气体的细胞外液中。
5. 磷酸盐缓冲液（PBS）：在800 mL H₂O中加入8 g NaCl、0.2 g KCl、1.4 g Na₂HPO₄和0.24 g KH₂PO₄，用NaOH调节pH至7.4，最后定容至1 L。
6. 0.2 M磷酸盐缓冲液：在800 mL H₂O中加入21.8 g Na₂HPO₄和6.4 g NaH₂PO₄，加水定容至1 L。
7. 4%多聚甲醛溶液：将50 mL H₂O加热至60 °C，加入4 g多聚甲醛，搅拌数分钟。滴加几滴1 M NaOH（约5滴），持续搅拌至溶液澄清。向烧杯中加入50 mL 0.2 M磷酸盐缓冲液。用pH试纸检测pH值（约为7.4）。过滤并冷却。
8. 封闭液（10%山羊血清，0.5% Triton X-100）：在1.8 mL PBS中加入0.2 mL山羊血清和10 μL Triton X-100。Triton X-100用于增加组织通透性。
9. 链霉亲和素溶液（5%山羊血清，0.5% Triton X-100，1:500链霉亲和素594）：在1.9 mL PBS中加入0.1 mL山羊血清、10 μL Triton X-100和4 μL链霉亲和素594。

2）从小鼠中分离视网膜

所需的解剖工具：1 把 #2 镊子，2 把 #5 镊子，眼科剪刀

1. 根据批准的实验方案处死小鼠，在本实验中采用 CO₂ 窒息法，然后用倾斜的 #2 镊子轻轻插入眼球后方，取出眼球。
2. 将眼球置于含有细胞外液的 35 mm 培养皿中。使用眼科剪刀剪断视神经及任何附着的眼外肌或结缔组织。用眼科剪剪除角膜，并用 #5 镊子取出晶状体。用一对 #5 镊子撕开巩膜，并用镊子在视盘处切断视网膜与巩膜连接的视神经。轻轻将视网膜从眼杯上剥离。提示：在进行下一步操作前，先对两只眼球的视网膜完成同一步骤，以缩短操作时间。
3. 用镊子去除附着在视网膜上的玻璃体。此步骤可通过用镊子“夹取”视网膜上方透明的玻璃体完成。若成功去除，玻璃体在镊子上呈现为透明胶状物质。提示：在去除玻璃体后将视网膜切成两半，可最大化可用组织量，并便于在记录 chamber 中安装。
4. 将视网膜置于室温、避光且环境光最小化的含氧细胞外液中，直至进行消化处理。视网膜以此方式可保存约 6 小时。

3) 用酶混合液处理视网膜并将其安装在记录室中

1. 将一份胶原酶/透明质酸酶溶液稀释于500 μL 细胞外溶液，将溶液置于35 mm培养皿中，并转移视网膜。
2. 将含有视网膜的培养皿保持覆盖并置于黑暗环境中，置于95% O2/5% CO₂气氛中₂ 在轻度振荡条件下孵育15分钟。此步骤有助于消化残留的玻璃体，并更便于接近神经节细胞层。提示：对于来自玻璃体较少的年轻动物的视网膜，或若观察到不良影响时，可将时间缩短至约5分钟。
3. 从含酶培养基中取出视网膜，并用细胞外液充分洗涤
4. 将视网膜转移至记录室 ⁶ 将感光细胞层朝下放置。使用移液管或滤纸吸除残留液体，轻轻卷起视网膜边缘使其展平，操作时注意仅接触视网膜边缘，特别避免触碰节细胞层。将带有尼龙网的铂金环置于视网膜上以固定组织，随后立即向记录室中加入细胞外液。
5. 将记录室安装到显微镜载物台上，连接重力灌流管和真空吸引管，并连接接地线。

4) 表达EGFP的神经节细胞的定位与光刺激

1. 以重力作用用细胞外液对视网膜进行灌流，流速为1 mL/min或更快。提示：若灌流速度过慢，组织将无法得到充分氧合，可能导致突触信号传递中断。
2. 用细胞内液填充记录电极，并将其插入电极夹持器中。提示：电阻在3至5 MΩ范围内的电极可获得最佳结果。
3. 在低倍率（10X物镜，NA 0.3）下使用红外微分干涉差（DIC）光学系统观察视网膜，以定位记录电极。使用红外光可最大限度减少视网膜对可见光的暴露，从而减少光适应。切换至高倍率（40X物镜，NA 0.8），并将电极移至组织上方视野中。
4. 在高倍率（40X物镜）下，使用落射荧光（EGFP为480 nm）照射视网膜，选择一个荧光标记的神经节细胞，并用胶带在计算机显示器上标记其位置（图1A）。
5. 在DIC和红外照明下，将记录电极移至目标神经节细胞附近（图1A）。通过连接至电极夹持器的聚乙烯管将12 mL塑料注射器施加轻微正压，清洁覆盖细胞的区域。在放大器上校零任何电压偏移。将电极轻压至选定的神经节细胞表面，直至细胞表面出现凹陷。
6. 将放大器置于电压钳模式，施加测试脉冲并监测通过电极的电流。施加负压以在电极与细胞之间形成封接。当细胞开始封接时释放负压，并等待保持电流稳定，表明细胞膜与电极之间已形成吉欧姆（GΩ）级电封接。施加轻微的负压脉冲，直至出现电容瞬变，随后释放所有压力。提示：若接入（串联）电阻较高（>30 MΩ），通常可通过额外施加非常轻微的负压脉冲加以改善。
7. 一旦形成稳定封接，施加一次负压脉冲。进入全细胞模式后，让细胞在暗环境中适应5分钟。在电流钳模式下记录其对全视野白光刺激的反应（图1B）。
8. 记录完成后，Alexafluor-594将扩散至树突。可在594 nm落射荧光下观察示踪剂，并通过在落射荧光与DIC红外光学之间切换，判断神经节细胞属于On型、Off型或双层型⁵。
9. 若电极内含有神经生物素且视网膜将用于免疫组织化学处理，则必须缓慢撤回电极，以尽量减少对细胞膜的破坏。

5) 记录的神经节细胞解剖学分析

使用神经生物素填充可在记录后对神经节细胞进行更详细的形态学分析。提示：如果需要获得记录的神经节细胞与详细形态之间的特定相关性，最好在每份制备样本中仅记录并填充一个视网膜神经节细胞（RGC）。

1. 如果细胞内液中包含神经生物素（neurobiotin），则将视网膜置于多聚甲醛溶液中，在 4°C 下固定过夜。
2. 用 PBS 缓冲液漂洗，至少 2 小时，至少更换 6 次。将视网膜转移至含有封闭液的培养皿中，在室温摇床上孵育 2 小时。
3. 用链霉亲和素溶液替换封闭液，在 4°C 摇床上孵育 2 天。用 PBS 缓冲液漂洗视网膜，共 6 次，每次 20 分钟。
4. 用 Vectashield 封片剂将视网膜封片于载玻片上，确保节细胞层朝上。进行共聚焦显微镜观察（图 1C）。

代表性结果

如果视网膜健康且解剖操作成功，在高倍微分干涉差（DIC）显微镜下应可见单个的节细胞（图1A）。不健康的视网膜会出现大而颗粒状的细胞核，应予以弃用。如果某个节细胞的突触反应保持完整，则该细胞应在光刺激开始或终止时产生动作电位，而对于内在光敏性节细胞（图1B），还会出现持续性去极化反应。

图1. 荧光标记的视网膜神经节细胞的定位、记录与染色。 （A）在40倍放大下，通过落射荧光照明观察到的GFP阳性视网膜神经节细胞（左图），以及通过微分干涉差（DIC）照明观察的同一细胞（右图）。（B）在荧光标记的视网膜神经节细胞上，以全细胞电流钳模式记录到的M2型内在光敏性视网膜神经节细胞的突触光反应。（C）M1型内在光敏性视网膜神经节细胞，在落射荧光下识别后，进行全细胞记录，用神经生物素灌注，并随后进行免疫组织化学处理。

讨论

该技术适用于从分离的视网膜中记录任何视网膜神经节细胞（RGC）的电活动。尽管上述实验所用小鼠品系中，内在光敏性、表达黑视蛋白（melanopsin）的RGC已被EGFP标记^{2, 5}，但本方案可轻松转移至其他荧光标记的RGC品系，也可推广用于随机选取的RGC记录。该技术特别有价值之处在于，每个RGC的树突分支及其相应的输入神经元均保持完全完整。记录可轻松在电流钳或电压钳模式下进行，也可采用细胞贴附式或松散封接式（loose-patch）构型，甚至可用于从视网膜神经节细胞膜上获取核膜片（nucleated patch）、膜内向外（inside-out）或膜外向外（outside-out）膜片构型。该技术可轻松调整用于记录荧光标记的移位无长突细胞⁷，甚至非移位无长突细胞⁸。利用荧光定位神经节细胞的一个局限性在于，在记录前必须始终以光照暴露视网膜以识别RGC。因此，除非灌流液中添加外源性发色团和/或保留眼杯及视网膜色素上皮与视网膜的连接⁹，否则该制备方法可能不适用于记录视杆细胞介导的反应。若目标是记录视杆细胞介导的光反应，则必须采取特殊预防措施以避免视紫红质...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ames’ 培养基	Sigma-Aldrich	A1420
胶原酶	Worthington Biochemical	LS005273
透明质酸酶	Worthington Biochemical	LS002592
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761
AlexaFluor 594 肼	Invitrogen	A10442
神经生物素	Vector Laboratories	SP1120
电极	Sutter Instrument Co.	BF120-69-10
镊子	Fine Science Tools	11252-30
眼科剪刀	Fine Science Tools	15000-00
链霉亲和素 594	Invitrogen	S32356
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
山羊血清	Jackson ImmunoResearch	005-000-001
曲拉通 X-100	Sigma-Aldrich	T8787
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	19210