一种用于记录遗传标记视网膜神经节细胞光反应的离体视网膜制备方法

摘要

本文介绍了如何对小鼠离体视网膜进行解剖和记录。具体而言，我们描述了如何记录荧光标记的视网膜神经节细胞群体对光刺激的反应，并进一步识别和分析其形态学特征。

摘要

脊椎动物视觉的最初步骤发生在光刺激视网膜的视杆细胞和视锥细胞时¹。随后，这些信息被分为所谓的“ON通路”和“OFF通路”。光感受器将光信号传递给双极细胞（BCs），这些细胞在光强度增加（ON BCs）或减少（OFF BCs）时发生去极化。这种光信息的分离在视网膜神经节细胞（RGCs）层面得以维持，RGCs的树突分别在内丛状层（IPL）的OFF亚层中分层，直接接收来自OFF BCs的兴奋性输入，或在IPL的ON亚层中分层，直接接收来自ON BCs的兴奋性输入。关于光照增强或减弱的信息分离（即ON和OFF通路）被保守地并行传递至大脑。

视网膜神经节细胞（RGCs）是视网膜的输出细胞，因此研究这些细胞对于理解光信号如何传递至脑内视觉核团具有重要意义。近年来，小鼠遗传学的进展已催生出多种荧光报告小鼠品系，其中特定的RGC群体被荧光蛋白标记，从而可识别RGC亚型^{2 3 4}，并实现电生理记录中的特异性靶向。本文介绍一种在完整、离体的视网膜制备标本中记录荧光标记神经节细胞光反应的方法。该离体视网膜制备标本可保留RGC的树突分支结构及其整个树突域上的输入连接，从而实现对RGC的记录。该方法适用于多种神经节细胞亚型，并可与多种单细胞生理学技术结合使用。

方案

动物使用声明： 动物的饲养和管理遵循所述指南中的规定 实验动物护理和使用的指南，采用明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会批准的方案。

1）溶液的配制

1. 在进行电生理记录之前，需要配制细胞内液、细胞外液和酶溶液。
2. 细胞外液：将一瓶（8.8 g）粉末状Ames培养基（Sigma）与1 L H₂O和1.9 g碳酸氢钠（23 mM）混合。在整个操作过程中，细胞外液需持续用95% O₂/5% CO₂混合气体饱和。取200 mL转移至烧杯中用于视网膜保存。剩余溶液置于灌流系统的容器中，待视网膜安装后用于重力灌流。
3. 细胞内液：细胞内液应预先配制，并分装为500–1000 μL的等分试样，于-20 °C保存。细胞内液的配方根据实验需求有所不同；本实验中用于电流钳记录的配方（单位为mM）如下：125 K-葡萄糖酸盐、2 CaCl₂、2 MgCl₂、10 EGTA、10 HEPES、2 Na₂-ATP、0.5 NaGTP，用KOH调节pH至7.2⁵。可加入10 μM Alexafluor-594 肼（Invitrogen）等荧光示踪剂以在实验过程中观察树突形态，也可加入0.3%神经生物素（neurobi....

讨论

该技术适用于从分离的视网膜中记录任何视网膜神经节细胞（RGC）的电活动。尽管上述实验所用小鼠品系中，内在光敏性、表达黑视蛋白（melanopsin）的RGC已被EGFP标记^{2, 5}，但本方案可轻松转移至其他荧光标记的RGC品系，也可推广用于随机选取的RGC记录。该技术特别有价值之处在于，每个RGC的树突分支及其相应的输入神经元均保持完全完整。记录可轻松在电流钳或电压钳模式下进行，也可采用细胞贴附式或松散封接式（loose-patch）构型，甚至可用于从视网膜神经节细胞膜上获取核膜片（nucleated patch）、膜内向外（inside-out）或膜外向外（outside-out）膜片构型。该技术可轻松调整用于记录荧光标记的移位无长突细胞⁷，甚至非移位无长突细胞⁸。利用荧光定位神经节细胞的一个局限性在于，在记录前必须始终以光照暴露视网膜以识别RGC。因此，除非灌流液中添加外源性发色团和/或保留眼杯及视网膜色素上皮与视网膜的连接⁹，否则该制备方法可能不适用于记录视杆细胞介导的反应。若目标是记录视杆细胞介导的光反应，则必须采取特殊预防措施以避免视紫红质.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ames’ 培养基	Sigma-Aldrich	A1420
胶原酶	Worthington Biochemical	LS005273
透明质酸酶	Worthington Biochemical	LS002592
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761
AlexaFluor 594 肼	Invitrogen	A10442
神经生物素	Vector Laboratories	SP1120
电极	Sutter Instrument Co.	BF120-69-10
镊子	Fine Science Tools	11252-30
眼科剪刀	Fine Science Tools	15000-00
链霉亲和素 594	Invitrogen	S32356
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
山羊血清	Jackson ImmunoResearch	005-000-001
曲拉通 X-100	Sigma-Aldrich	T8787
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	19210