本方案概述了分离、通过电穿孔转染以及培养小鼠海马和皮层神经元所需的步骤。短期培养可用于轴突生长和导向研究，而长期培养则适用于突触形成和树突棘分析的研究。
本文内容
摘要
摘要
海马和皮层神经元已被广泛用于研究中枢神经系统（CNS）神经元的极化、轴突/树突的生长以及突触的形成与功能。培养这些神经元的一个优势在于，它们能够在二维基质上以极低密度迅速建立极性，形成形态分明的轴突和树突。这一特性使其在揭示神经元发育多个方面的机制中极为有用。此外，通过为这些神经元提供胶质细胞条件化培养环境，它们能够持续发育，形成具有功能的突触连接，并在体外存活数月。本实验方案中，我们描述了一种分离、培养和转染胚胎小鼠海马及皮层神经元的技术。转染通过核转染法（nucleofection）在铺板前对神经元进行电穿孔导入DNA来实现。该方法的优势在于可在神经元发育早期（铺板后约4–8小时）即表达荧光标记的融合蛋白，从而研究蛋白质在极化、轴突发育及分支过程中的动态变化与功能。我们还发现，在铺板前进行一次转染即可在整个神经元生命周期内维持荧光标记融合蛋白的表达水平，足以满足成像需求。> 培养2个月）。因此，该方法可用于研究中枢神经系统发育过程中蛋白质的定位与功能，且对神经元功能的干扰极小或几乎没有。
方案
1. 盖玻片和培养腔的制备
- 清洁盖玻片和培养腔的制备对于获得健康的细胞培养至关重要，这些步骤中的任何捷径都不应采取。
- 将盖玻片（12 mm 或 22 mm 圆形，德国玻璃 — Carolina Assistant 品牌）在专用玻璃瓶或烧杯中的浓硝酸（HNO₃）中浸泡过夜。
- 将盖玻片从硝酸中取出，并用去离子水彻底冲洗 5 至 7 次。
- 将盖玻片分开，并在层流罩或生物安全柜中干燥。干燥后，用紫外光照射 30 分钟进行灭菌。将灭菌后的盖玻片放入无菌培养皿中储存。若需将神经元直接接种于 12 mm 盖玻片上，则将盖玻片置于无菌 35 mm 培养皿中，并进入第 2 节操作。
- 通过在 35 mm 培养皿底部钻一个 15 mm 的孔（去除所有毛刺），并用石蜡与凡士林按 3:1 比例混合的封固剂将清洁的盖玻片密封，从而构建成像腔室。
- 在沸水浴中将锥形管内的石蜡/凡士林混合物融化。使用小号画笔，在培养皿底部围绕 15 mm 孔的区域均匀涂布。注意持续搅拌混合物，以防其分层。若混合物分离，会导致封固时凡士林浓度过高，当培养皿放入培养箱后会变得黏稠，从而引起盖玻片脱落。剩余的石蜡/凡士林混合物可在室温下保存。
- 将培养皿倒置放在平坦托盘上，将盖玻片覆盖在孔上。放入 80°C 烤箱中加热至石蜡混合物完全融化（约 10 分钟）。取出后平放，使石蜡混合物凝固。
- 将培养皿翻转过来，用紫外光对盖玻片内表面及腔室底部进行灭菌。
- 用 1.0 mg/mL 多聚-L-赖氨酸（30 kDa）溶于硼酸盐缓冲液（0.1 M 硼酸钠，pH 8.5）中，在盖玻片或腔室的玻璃区域包被 1 小时。随后用大量组织培养级去离子水冲洗 3 至 5 次，确保完全去除硼酸盐缓冲液残留。干燥后立即使用，或储存腔室/盖玻片以备后续使用。我们通常在盖玻片制备后一个月内使用。
2. 神经元分离与培养基的制备
- 通过向组织培养级水中加入适量的10倍浓度HBSS和100倍浓度HEPES来配制解剖培养基（DM）。4°C保存。解剖过程中保持在冰上。
- 解剖前一天配制铺板培养基（PM）和无血清培养基（SFM）。PM由Neurobasal培养基、B27添加剂、2 mM谷氨酰胺、0.3%葡萄糖、37.5 mM NaCl和5%胎牛血清（FBS）组成。SFM由Neurobasal培养基、B27添加剂、2 mM谷氨酰胺、0.3%葡萄糖和37.5 mM NaCl组成。
- 仅配制解剖所需量，并将培养基瓶盖稍拧松，置于组织培养孵箱中过夜，使培养基的温度和CO2含量达到平衡。我们额外添加葡萄糖，并通过NaCl将渗透压调节至约310 mOsm。我们发现，在更接近生理状态的渗透压下（Neurobasal培养基的渗透压通常为205–245 mOsm），细胞培养效果更佳。
3. 长期培养用皮质胶质细胞饲养层的制备
- 若需制备长期培养物，应在进行皮层或海马组织分离前两到三周完成本步骤。
- 配制胶质细胞培养基（GM），包含 MEM、0.3% 葡萄糖、青霉素/链霉素和 10% 马血清。
- 将 P1-P3 小鼠幼崽置于冰上冷却 5 分钟以实施安乐死。将每只幼崽从冰上取出后，喷洒 70% 乙醇。用剪刀迅速断头。将完整脑组织移至含有冷 DM（步骤 2.1）的培养皿中。
- 去除两个大脑半球及脑膜。切除新皮层并转移至不含培养基的新培养皿中。共制备4个脑组织的新皮层。
- 用干净且无菌的剃刀刀片将皮层尽可能切碎，然后用塑料移液管将切碎的组织转移至含有12 mL冷DM的50 mL锥形管中。加入胰蛋白酶和DNase，使其终浓度分别为0.25%（1.5 mL）和0.1%（1.5 mL）。在37°C水浴中孵育 37°C 水浴10分钟，期间间歇性摇动。
- 将装有皮质组织的离心管取出，在移入组织培养操作台前用70%乙醇彻底清洁。用10 mL移液器反复吹打皮质组织约10–15次，或直至大部分组织块消失。
- 将试管放回 37°C 在水浴中再孵育10分钟，期间间歇性轻轻摇晃。
- 用70%乙醇彻底清洗试管，并将其放回组织培养操作台。用5 mL移液器将皮质组织上下吹打约10–15次，直至组织块消失。
- 加入15 mL预热的GM，以200×g（1000 rpm）离心10分钟。
- 弃去上清液，将沉淀的细胞重悬于 20 mL 新鲜 GM 中，用血细胞计数板计数。接种 5–7.5×106 每75 cm²加入15 mL GM培养基的细胞2 烧瓶
- 培养一天后，以及此后每2-3天，通过轻敲培养瓶使其与手掌碰撞以松动未贴壁细胞。吸除培养基及脱落的细胞，并更换为15 mL新鲜生长培养基（GM）。
- 当培养瓶中的胶质细胞生长 1-2 周并达到约 70–100% 汇合度时，即可收获。为制备单个胶质细胞包被的盖玻片，将 6 片经硝酸清洗并灭菌的 25 mm 圆形盖玻片放入 10 cm 培养皿中，用小号画笔在每片盖玻片上以三角形排列方式滴加 3 滴石蜡/凡士林（3:1）混合物。将敞开的培养皿用紫外光照射处理 30 分钟。随后在硼酸盐缓冲液中加入 0.1 mg/mL 多聚-L-赖氨酸（30 kDa），包被盖玻片 1 小时，然后用无菌组织培养级去离子水充分洗涤（3–5 次），晾干备用。
- 从培养箱中取出含胶质细胞的培养瓶，弃去培养基，用 5 mL 预热的胰蛋白酶/EDTA 溶液冲洗。移除胰蛋白酶/EDTA 溶液，再用移液器向培养瓶中加入 3 mL 新鲜预热的胰蛋白酶/EDTA 溶液。将培养瓶于 37°C 孵育 1 分钟 37°C 加入5 mL生长培养基以终止消化反应。
- 通过反复吹打10–15次将胶质细胞从培养瓶中吹下，随后将培养基转移至15 mL离心管中。在200×g（1000 rpm）下离心8分钟。弃去上清液，加入10 mL GM培养基，计数细胞后接种5×10⁵个细胞5 每10 cm培养皿中加入12.5 mL GM培养基，内含盖玻片上的细胞。
- 每2-3天更换一次新鲜的预热生长培养基（GM）。在神经元解剖前一天，移除GM并替换为无血清培养基（SFM）（见第2.2节）。在第4.12步对皮层或海马神经元培养物进行灌注时，使用此胶质细胞条件化SFM。
4. 皮层和/或海马解剖与电穿孔
- 取出适量的核转染溶液（Lonza），混合后在开始解剖前升温至室温。由于核转染溶液混合后有效期有限，我们仅针对每次制备配制所需用量（每次转染使用100 μL）。
- 使用CO2处死E15.5阶段的怀孕小鼠（以发现阴栓当天记为E0.5），将子宫取出并置于10 cm培养皿中。取出胎鼠，去头后放入冷DM溶液中（见第2.1节）。
- 将整个大脑取出并放入另一盛有冷DM的培养皿中，用弯头钨针分离两侧新皮层。用显微镊去除脑膜，将皮层组织转移至新的冷DM培养皿中。使用小型虹膜剪或Wecker剪分离皮层或海马组织，并将其放入已装有1.0 mL冷DM的1.5 mL离心管中。将该离心管置于冰上保存。
- 在完成所有皮层或海马组织的解剖后，向含有组织的离心管中加入110 μL 2.5%胰蛋白酶溶液，并将离心管置于37°C培养箱中孵育20分钟。
- 去除上清液，用1.0 mL PM溶液（见第2.2节）轻轻颠倒离心管以洗涤皮层或海马组织。重复洗涤两次，每次洗涤后在管中保留1 mL PM溶液。
- 使用P1000移液器将组织块吹打15次，将上清液/细胞转移至含有4 mL PM的新15 mL锥形管中，离心管中残留的未分散组织块弃去。
- 将15 mL离心管在20×g（350 rpm）条件下离心7分钟（关闭刹车）。弃去上清液，为每次转染加入100 μL预混并已平衡至室温的核转染溶液（Lonza）。用P1000移液器轻柔吹打5次使细胞重悬。
- 将100 μL核转染溶液/细胞混合物转移至新的1.5 mL离心管中，并加入适量DNA。对于长期培养，我们通常每转染使用1–2 μg DNA，但这仅能标记培养物中少量（<10%）的神经元。若需在短期培养中获得更高的转染效率，我们通常每转染使用5–10 μg DNA。当使用两种不同质粒共转染时，我们最多使用总量达40 μg的DNA。质粒储存于TE缓冲液中，浓度为1 μg/μL。
- 将细胞悬液/DNA混合物加入电转杯（Lonza）中，使用Nucleofector（Lonza）仪器并选择程序O-005（小鼠中枢神经系统神经元）进行电穿孔。
- 迅速操作，向电转杯中加入500 μL预热并已平衡的PM溶液，将溶液/细胞转移至新的1.5 mL离心管中。补加PM溶液使每次转染总体积达到1.0 mL。使用血细胞计数板计数细胞，并以3–5×103 个细胞/cm2密度接种用于短期培养，或以5–10×103 个细胞/cm2密度接种用于长期培养。
- 对于短期培养，在接种1小时后，向35 mm培养皿中加入2.0 mL预热并经CO2平衡的无血清培养基（SFM）。若使用盖玻片，我们先移除一半PM溶液，替换为SFM，再重复此步骤两次。无论是直接向成像培养皿中加满培养基，还是对盖玻片进行洗涤，最终均使培养体系中血清含量极低（<0.5%）。短期培养无需使用胶质细胞饲养层，也无需更换培养基。
- 对于长期培养，在初次接种1小时后，将一个覆盖有胶质细胞且带有三滴石蜡/凡士林的盖玻片翻转，覆盖在35 mm培养皿的15 mm孔上。随后向成像培养皿中加入2 mL来自胶质细胞培养皿的条件化SFM。为维持长期培养，每2–3天更换三分之一的SFM，并补充新鲜的、预热且经CO2平衡的SFM。
5. 代表性结果：
图1. 海马神经元在发育连续阶段的活细胞图像。 代表性活体海马神经元的成对图像分别显示为微分干涉相差图像及相应的荧光显微照片。这些细胞均使用含EGFP-Tubulin和DsRed2的pCAX载体进行转染。神经元在以下时间点进行成像 体外 （体外培养天数）：第1阶段（1DIV）、第2阶段（1DIV）、第3阶段（2DIV）、第4阶段（11DIV）和第5阶段（32DIV）。比例尺为 20μm.
讨论
本实验方案用于培养胚胎期小鼠海马和皮层神经元，是在Banker方案基础上改进而来，原始Banker方案使用大鼠神经元1,2。我们亦已将该方案成功应用于小鼠和仓鼠神经元的培养3,4,5,6,7。该方案对海马神经元和新皮层神经元均具有良好的培养效果，且与Meberg和Miller发表的某一方案相似8。通常情况下，我们选择海马神经元进行长期培养，因其特性明确，是更为成熟和广泛应用的模型系统。此外，海马神经元群体可能比新皮层神经元更为均一。然而，采用本方案培养的新皮层神经元同样能够良好存活并正常分化（未发表数据）。我们常规使用海马和新皮层神经元进行短期培养。此外，新皮层解剖所获得的神经元数量显著多于海马组织（每对皮层可获得约1.5×106个神经元，而每对海马仅获得约2.5×105个神经元），因此在进行如Western blot等需要较多材料的实验时，新皮层是更优的组织来源。
与任何原代培养一样，必须尽量缩短从动物死亡到细胞接种之间的时间。通常需要进行10至20次解剖操作，才能熟练掌握快速解剖和接种技术。此外，使用Lonza Nucleofector进行电穿孔时，操作必须迅速，因为神经元若在核转染缓冲液中停留过久，其活力会迅速下降。
我们的成像工作大部分采用全内反射荧光显微镜（TIRFM）进行。这种显微镜技术仅能对盖玻片表面以下几百纳米范围内的结构进行成像。因此，我们经常观察的神经元区域，如轴突生长锥和树突棘，必须直接贴附在盖玻片上。为此，我们使用低密度培养体系，这种体系需要胶质细胞作为饲养层以维持长期培养。我们也曾尝试使用较高密度的培养（>2×104 个细胞/cm2），不添加胶质饲养层，发现这些神经元在较少换液的情况下仍能很好地存活。然而，这些神经元的树突棘通常距离基质过远，无法通过TIRFM进行有效成像，尽管它们可以很容易地通过宽场显微镜或共聚焦显微镜检测到。
在大多数研究中，我们在铺板前对神经元进行转染，并在培养中对荧光标记蛋白进行了长达三个月的成像观察。这种长期表达荧光标记蛋白的结果使我们确信，使用低浓度DNA（1–2 μg）不会在神经元中产生过表达相关的人为假象。然而，若使用高量DNA（10–20 μg），该方法也可用于研究蛋白的过表达。我们用于转染神经元的质粒通常包含EGFP或mCherry融合蛋白，尽管我们也单独使用DsRed2或EGFP标记神经元胞质。该电穿孔技术适用于多种载体。由于表达水平相对较高，且在短期和长期培养中神经元对该类质粒耐受性良好，我们更倾向于使用含有β-actin启动子、CMV增强子以及β-globin多聚腺苷酸尾的质粒（如pCAGGs或pCAX质粒）9。通常，蛋白在铺板后约4小时开始表达，并在10–24小时内达到可用于成像的水平10。我们已在短期培养中成功使用由CMV启动子驱动的质粒，但发现其可能导致高水平的过表达，从而在长期培养中引起神经元死亡。尽管如此，我们发现与高密度（非胶质细胞滋养）培养相比，低密度培养中胶质细胞的条件化处理有助于提高转染了CMV启动子驱动质粒的神经元的存活率。
致谢
所有实验程序均经威斯康星大学动物护理委员会批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）的指导方针。我们感谢Katherine Kalil博士慷慨提供Nucleofector设备的使用。同时感谢Dent实验室成员对本实验方案提出的建议。本研究工作得到了NIH R01-NS064014基金、Dana基金会和Whitehall基金会对E.W.D.的资助支持。
Christopher Viesselmann、Jason Ballweg 和 Derek Lumbard 对本论文贡献相同。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 硼砂 | Fisher Scientific | S93356 | 将硼酸盐缓冲液在室温（RT）下保存。 |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P7886-100mg | 溶于0.1 M 硼酸盐缓冲液中。经无菌滤器过滤后，分装并储存在-80℃°C. |
| 胰蛋白酶（10倍浓缩液） | Invitrogen | 15090-046 | 将分装样品于 -80 保存°C. |
| DNase（10倍浓度） | Sigma-Aldrich | DN25-1G | 将分装样品于 -80 保存°C. |
| MEM | Invitrogen | 11095-080 | 4°C 下保存°C. |
| HBSS（10倍浓度） | Invitrogen | 14185-052 | 室温保存。 |
| HEPES（100倍浓缩液） | Invitrogen | 15630-080 | 4°C 下保存°C. |
| 青霉素/链霉素（100倍浓缩） | Invitrogen | 15140-122 | 将分装样品于 -80 保存°C. |
| 马血清 | Hyclone | SH3007403 | 将分装样品于 -80 保存°C. |
| 胰蛋白酶/EDTA | Invitrogen | 25200-056 | 4°C 下保存°C. |
| Neurobasal E (NB) | Invitrogen | 21103-049 | 4°C 保存°C. |
| B27添加剂（50倍浓缩） | Invitrogen | 17504-044 | 将分装样品于 -80 保存°C. |
| 谷氨酰胺（100倍） | Invitrogen | 25030-081 | 将分装样品于 -80 保存°C |
| NB 中的 30% 葡萄糖（100 倍浓缩液） | Fisher Scientific | BP350-500 | 将葡萄糖溶解于NB中并进行无菌过滤。4 ℃保存。°C. |
| NB 中的 3.75 M NaCl（100 倍浓缩液） | Fisher Scientific | BP358-1 | 将 NaCl 溶解于 NB 中并进行无菌过滤。4 ℃ 保存。°C. |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | SH3007003 | 将分装样品储存在 -80°C. |
| 石蜡/凡士林（3:1，质量比） | Fisher Scientific | 石蜡 – P31-500 石油 – P66-1 | 在锥形管中混合，并于沸水中熔化。 |
| 浓硝酸（HNO₃） | Fisher Scientific | A509-212 | 室温保存。可重复使用数次。若变黄则弃用。 |
| 5 mM 胞嘧啶 –盐酸阿糖胞苷（AraC）在NB中（1000倍浓缩） | Sigma-Aldrich | C6645 | 将AraC溶解于NB中，经无菌滤膜过滤，于-80℃保存°C |
我们储存于 -80 的大多数试剂°C 可在 -20 保存°C 也是如此。在 -80 保存°C 延长了其保质期，并使培养物更加稳定一致。 |
参考文献
- Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Chapter 13. Culturing Nerve Cells. Goslin, K., Banker, G. , The MIT Press. 339-370 (1998).
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- Dent, E. W. Filopodia are required for cortical neurite initiation. Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).
- Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines. J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).
- Lebrand, C. Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1. Neuron. 42, 37-49 (2004).
- Meberg, P. J., Miller, M. W. Chapter 7. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. , Academic Press. Volume 71 112-129 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Zeitelhofer, M. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
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