本文介绍了一种从雌性黑寡妇蜘蛛腹部高效去除丝腺的策略。该方法能够快速分离出七种不同类型的丝腺，且纯度较高，对于研究蜘蛛丝生成和纤维组装的科研人员而言，这一过程至关重要。
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摘要
摘要
现代蜘蛛能够纺出具有多种生物学功能的高性能丝纤维，包括运动、捕食以及保护发育中的后代1,2。蜘蛛通过纺制多种不同类型的纤维来完成这些任务，这些纤维具有各异的力学性能。纤维类型的这种特化是通过进化出不同的丝腺实现的，这些丝腺作为小型生物工厂发挥作用。这些生物工厂负责制造并储存大量丝蛋白，以用于纤维的生产。通过一系列复杂的生化过程，这些丝蛋白在挤出时从液态转化为固态物质。
力学研究表明，蜘蛛丝的强度超过高抗拉强度钢3。对蜘蛛丝纤维结构与功能关系的分析表明，蜘蛛丝主要由蛋白质（即丝心蛋白）构成，这些蛋白质在其氨基酸序列中具有重复的模块结构4。通过对丝腺cDNA的翻译产物进行分析，研究人员正在逐步揭示赋予蜘蛛丝惊人抗张强度和延展性的共同分子特征。鉴于蜘蛛丝卓越的材料特性，全球各地的研究实验室正竞相深入了解并模拟其纺丝过程，以制备可用于商业、军事和工业领域的合成蜘蛛丝纤维。在实验室中人工纺制蜘蛛丝面临的主要挑战之一，是对纤维从丝腺挤出过程中所发生的生化过程进行全面理解。
本文介绍了一种从结网型黑寡妇蜘蛛中分离七种不同丝腺的方法，包括大壶状腺和小壶状腺[分别产生牵引丝和支架丝]5,6、管状腺[合成卵囊丝]7,8、鞭状腺[在结网蜘蛛中的功能尚不明确]、凝集腺[产生黏性丝]、梨状腺[产生附着盘丝]10以及aciniform腺[合成包裹猎物和卵囊的丝线]9。该方法基于使用二氧化碳气体对蜘蛛进行麻醉，随后将头胸部与腹部分离，并对腹部进行显微解剖以获取丝腺组织。在分离出不同类型的丝腺后，这些组织可用于提取多种大分子，以进行不同的生化分析，包括实时定量PCR、Northern印迹和Western印迹、质谱（MS或MS/MS）分析，以鉴定新的丝蛋白序列，筛选参与丝蛋白组装通路的蛋白质，或利用完整组织进行细胞培养或组织学实验。
方案
1. 麻醉蜘蛛并分离腹部
- 将蜘蛛从玻璃罐转移到内衬塑料膜的纸盒中（图1A）。我们通常从木堆、车库或灌木丛中采集蜘蛛，并在实验室的玻璃罐中饲养。由于蜘蛛无法攀爬塑料内衬，因此这是一种有效的转移方法，可将蜘蛛从玻璃罐或咖啡罐转移到较小的样品瓶中，以便进行麻醉。在此过程中操作蜘蛛时，出于安全考虑，应佩戴两层乳胶手套或园艺手套。
- 当蜘蛛位于内衬塑料膜的纸盒中时，从其后方接近，让蜘蛛滑入塑料培养管中。蜘蛛进入管内后，立即盖上塞子（图1B）。建议使用尺寸约为101.6 mm × 31.75 mm（长×直径）的样品管。这样可最大限度减少麻醉步骤所需的二氧化碳气体用量。
- 以5–10 psi的压力通入二氧化碳气体，持续10分钟，使蜘蛛麻醉（图1C）。此剂量的气体仅能使蜘蛛失去活动能力约5分钟，因此麻醉后必须立即进行步骤1.4–1.5。
- 将麻醉后的蜘蛛放入小型解剖皿中，用镊子将其调整为背面向上（红色沙漏斑纹朝下）。
- 剪断连接头胸部与腹部的细柄状结构（即柄部），使腹部与蜘蛛其他部分分离（图1D）。将头胸部放入培养皿中，置于冰箱冷冻过夜，次日冻实后丢弃。移动头胸部时需小心，因为蜘蛛的毒牙位于该部位。
- 用一根昆虫针将腹部固定在小型解剖皿内的Sylgard材料上。将昆虫针穿过剪断柄部后留下的孔洞（图1E），该位置通常可见液体渗出，易于识别。确保纺器（与柄部相对的一端）朝向解剖皿底部（即靠近操作者的一侧）。
2. 去除外骨骼
- 使用一对显微剪刀从足柄切除处的孔开始，穿过外骨骼进行第一次切口，向两侧横向剪开，直至到达背侧（图1F）。用一对镊子将前部外骨骼片段掀开，并在此位置插入第二根固定针。插入第二根固定针后，将解剖托盘转向尾侧，与最初的横向切口呈90°角，继续剪切直至到达纺器（图1G）。此次切口应与初始的横向切口垂直或呈竖直方向。进行竖直切口时，切勿剪断纺器（位于沙漏状结构后方，呈圆形外观）。若未插入第二根固定针，在进行竖直切口时会导致腹部发生旋转。
- 将腹部浸入解剖缓冲液（0.1 M 氯化钠，0.015 M 柠檬酸钠，0.1% 焦碳酸二乙酯）中。
- 从初始的横向切口处开始，向后剥离剩余的外骨骼。完成此步骤后，脂肪组织应清晰可见（图1H）。
3. 蚕丝腺体的分离
- 使用镊子开始剥离脂肪层（图1H）。脂肪呈白色至淡黄色。持续操作直至大部分脂肪被去除，丝腺清晰可见。管状腺由三对非常长的圆柱形管组成，大量存在于腹部腔内。大壶腹腺成对存在，为大型新月形壶腹，具有一条长而盘绕的远端尾部，以及一条向蜘蛛纺丝器方向延伸时逐渐变窄的近端导管。小壶腹腺在形态上与大壶腹腺非常相似，但明显更小。鞭状腺也成对存在，呈圆形且多叶状，具有一条向下延伸至纺丝器的小型圆柱形锯齿状导管。粘液腺（成对存在）为一个非常大的多叶状腺体，具有一条非常大的排泄导管，其上带有大型不规则的叶状结构。环状腺数量众多，形似短小的指状突起。梨状腺是腹部最小的腺体，具有许多紧密排列的圆柱形导管，形似扇形，具许多向下延伸至纺丝器的小排泄导管。
- 我们建议按以下顺序移除腺体：管状腺、大壶腹腺、鞭状腺、小壶腹腺、粘液腺、环状腺，最后是梨状腺（图2A-B）。
- 首先从管状腺开始，将其从其他腺体上小心分离——它们应位于其他腺体的上方（图2A）。一只蜘蛛体内有三对管状腺。使其自由漂浮，但仍通过导管与纺丝器相连。
- 接下来，分离大壶腹腺。一只蜘蛛体内存在两个大壶腹腺。在移除过程中，确保导管仍与腺体相连（图2A）。
- 继续将其余腺体彼此分离，操作时需小心，避免刺破任何腺体，尤其是粘液腺和鞭状腺。每个腺体应从其在体壁上的出口直至纺丝器全程自由漂浮。这些腺体也成对存在。用镊子夹住导管，小心拉扯，直至其从出口处断开，从而移除每个腺体。大壶腹腺、鞭状腺、小壶腹腺和粘液腺均成对存在。环状腺和梨状腺则具有更多对。
- 用镊子夹住导管，小心拉扯，直至腺体从纺丝器附近的出口处断开。我们通常将腺体以湿润状态储存；但不会额外添加缓冲液。
- 在移除腺体后，将其放入无菌且预先标记的1.5 ml微量离心管中。各单个腺体如图3A-G所示。将这些腺体保持在冰上，随后在液氮中快速冷冻。在液氮中快速冷冻后，置于-80°C保存。
4. 代表性结果
在分离不同腺体时，操作鞭状腺和复合腺需格外小心，因为这两种结构极易被镊子刺破或损伤。此外，值得注意的是，在分离前鞭状腺和复合腺在形态上非常相似，且常相互缠绕。为防止在分离过程中这些组织发生交叉污染，解剖者应仔细将这些结构分开。另外，在初次暴露产丝腺体时，由于环状腺和梨状腺体积较小且解剖位置较深，通常最难立即辨识。通常可见大量卵粒存在。此外，在分离梨状腺时还需格外小心，因为该组织具有极强的黏性，常会黏附于镊子上。若操作得当，可从一只蜘蛛中高度纯化地获取全部七种产丝腺体。通常，一次单只蜘蛛的解剖可获得微克量级的总RNA和蛋白质。图4展示了利用总RNA进行qPCR分析，检测仅在管状腺中表达的纤连蛋白基因TuSp1的mRNA水平的示例。图5和图6分别展示了利用腺体收集的蛋白裂解液进行的代表性实验，例如溶液内胰蛋白酶消化后进行质谱（MS）分析（也可用于MS/MS分析）或氨基酸组成分析。
图1. 雌性黑寡妇蜘蛛的处理、麻醉以及腹部外骨骼的去除。A) 将蜘蛛转移至内衬塑料膜的纸盒中，以便将其移入较小的塑料小瓶。B) 将蜘蛛放入带塞的塑料小瓶中。C) 使用二氧化碳气体对蜘蛛进行麻醉。D) 使用显微剪刀将头胸部与腹部分离。E) 使用昆虫针将腹部固定在解剖盘中以实现固定。F) 用剪刀进行侧向切口，并用镊子将部分外骨骼掀开后的视野。G) 正对初始侧向切口进行垂直方向的切口操作。H) 去除外骨骼并暴露脂肪层。
图 2. 完整蜘蛛腹部中七种不同产丝腺体及其周围组织的可视化图示。A) 管状腺、大壶状腺、鞭状腺、凝胶状腺和小壶状腺组织在 12 倍放大下的图像。B) 球状腺和梨状腺在 12 倍放大下的图像。
图3. 从腹部取出的七种产丝腺体的照片。所有图像均以20倍放大倍数拍摄，仅腺泡状腺和梨状腺以40倍放大倍数拍摄。A）大壶腹腺；B）大壶腹腺和小壶腹腺（右侧），用于尺寸比较；C）管状腺；D）鞭状腺；E）聚集腺；F）腺泡状腺；G）梨状腺。
图4. 通过定量实时PCR（qPCR）检测不同丝腺（不包括梨状腺）中TuSp1 mRNA的表达水平，在提取各腺体总RNA后，获得丝基因TuSp1表达模式的代表性结果。
图 5. 对来自梨状腺的蛋白质提取物经溶液内胰蛋白酶消化后进行质谱分析的示例。注意：x2 表示谱图强度放大 2 倍。对应于 PySp1 纤连蛋白区域的肽离子质量用符号 # 标注。
图6. 从管状腺提取的蛋白质的氨基酸组成谱的典型结果。注意：ASX = Asp 和 Asn；GLX = Glu 和 Gln。蓝色表示具有极性侧链基团的氨基酸，而红色表示具有非极性侧链基团的氨基酸残基。
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讨论
我们提供的黑寡妇蜘蛛丝腺显微解剖方法，是一种获取高纯度丝腺组织的有效手段。解剖过程可在1.5至3小时内完成，能够从结网型蜘蛛中分离出全部七种不同类型的丝腺。获得高纯度的丝腺样本使研究人员能够开展多种生物化学研究，包括利用质谱技术鉴定腺腔内容物中储存的新丝蛋白或分子伴侣蛋白、分析在不同类型腺体中选择性表达基因的mRNA水平，以及特定腺体的体外培养。 体外 研究蚕丝生产的机制。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国家科学基金会RUI基金（项目编号：MCB-0950372）资助，项目名称为“黑寡妇蜘蛛丝的分子表征”。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化钠 | Electron Microscopy Sciences | SX0420-1 | 水中 0.1 M |
| 焦碳酸二乙酯 | Sigma-Aldrich | D-5758 - 5 ml | 0.1% v/v |
| 柠檬酸钠 | Sigma-Aldrich | S1804 - 1 kg | 水中 0.015 M |
| 解剖显微镜 | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| 数码显微镜相机 | Leica Microsystems | DFC320 | 软件 - Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas 剪刀 | World Precision Instruments, Inc. | 500260 | |
| 不锈钢镊子 | World Precision Instruments, Inc. | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| 昆虫针 | Indigo Instruments | 33414-2 | 昆虫针 #2 |
| 小型或大型解剖皿 | Living Systems Instrumentation | DD-50-S 或 DD-90-S | 52 mm 直径 × 18 mm 高（Sylgard 深度约 6 mm）或 93 mm × 22 mm |
| Drosophila 培养管 | Carolina Biological | FR-17-3076 | 尺寸为 31.75 mm 直径 × 101.6 mm |
参考文献
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- Lewis, R. V., Xu, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).
- Colgin, M. A., Lewis, R. V. Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).
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