哺乳动物细胞中mRNA核输出动力学的显微注射分析

摘要

本文介绍了一种检测方法，该方法结合显微注射与荧光原位杂交技术，以准确测定哺乳动物体细胞中mRNA的核输出动力学。

摘要

在真核生物中，信使RNA（mRNA）在细胞核内转录，必须被转运至细胞质中才能接触翻译机制。尽管mRNA的核输出已在多种体系中被广泛研究 非洲爪蟾卵母细胞¹ 以及遗传操作简便的生物体，如酵母² 和 果蝇 衍生S2细胞系³，但在哺乳动物细胞中的研究还很少。此外，哺乳动物体细胞中mRNA出核转运的动力学过程只能通过间接方法推断^4,5为了测量mRNA在哺乳动物组织培养细胞中的核输出动力学，我们开发了一种检测方法，该方法结合了显微注射与荧光技术的优势 原位 杂交（FISH）。这些检测方法已被用于证明，在哺乳动物细胞中，大多数mRNA以依赖剪接的方式被输出^6,7，或以需要特定RNA序列（如信号序列编码区，SSCR）的方式 ⁶在此实验中，细胞被显微注射以下任一物质 体外 含有目的基因的合成mRNA或质粒DNA。显微注射后的细胞在不同时间点孵育后固定，并通过FISH检测RNA的亚细胞定位。与转染技术中核酸加入后数小时才开始转录不同，DNA或mRNA的显微注射可实现快速表达，从而获得精确的动力学数据。

方案

有两种基于显微注射的方法可用于测量哺乳动物细胞中mRNA输出的动力学过程；即注射mRNA 体外 合成的 mRNA 或质粒 DNA，其被转录 体内 转化为mRNA。每种技术都有其优势和局限性。本文将介绍这两种技术，并讨论两种方法之间的差异。

1. 注射材料的准备

1. 体外转录的 mRNA
   1. mRNA 从含有目的基因的质粒或 PCR 产物中转录而来，目的基因的上游包含适当的 RNA 聚合酶启动子（例如 T7 或 SP6 启动子）。使用相应的酶（T7 或 SP6 RNA 聚合酶，Invitrogen）在 体外 进行转录，同时加入适当的核苷酸和过量的帽类似物。
   2. 根据制造商的说明，使用 Poly-A-聚合酶（Invitrogen）和 ATP 在 体外 对转录本进行多聚腺苷酸化。
   3. 然后使用 Invitrogen 或 Qiagen 的层析柱纯化 mRNA。
   4. 洗脱后的 mRNA 通过加入 1/20 体积的 3M 醋酸钾和 2 体积的 100% 乙醇，在 -20°C 下沉淀 1 小时，随后在 4°C 下以 13,000g 离心 30 分钟。如果残留液体较多，可用预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀。
   5. 所得的 mRNA 沉淀在空气中干燥后，溶于注射缓冲液（140mM KCl 和 10mM HEPES，pH 7.4）。需注意，任何残留的乙醇可能对显微注射的细胞具有毒性。溶解后的 mRNA 可在 -80°C 长期保存。
   6. 用于显微注射时，将 mRNA 用注射缓冲液稀释至 200μg/ml，并与 Oregon Green 488（OG）标记的 70kDa 右旋糖酐（1mg/ml；Invitrogen）混合。由于 OG 标记的右旋糖酐分子过大，无法通过核孔，因此不仅可用于识别已注射的细胞，还可帮助判断有多少液体被注入细胞核，以及有多少泄漏至细胞质（见 4.1.2）。此外，也可使用其他任何无法通过核孔的荧光高分子量分子。
   7. 在将样品装入注射针前，需在 4°C 下以 13,000g 离心至少 20 分钟，以沉淀可能堵塞针尖的颗粒物质。
2. 质粒 DNA
   1. 含有目的基因的质粒 DNA 可使用 Qiagen 的标准 DNA 纯化试剂盒制备。通常较大规模的 DNA 制备物质量更高，注射后转录效率也更高。
   2. 将质粒 DNA 用含 OG 标记的 70 kDa 右旋糖酐（1mg/ml）的注射缓冲液稀释至 50–200μg/ml。
   3. 在装入注射针前，注射液需在 4°C 下以 13,000g 离心至少 20 分钟。
3. 显微注射用针
   1. 注射针由 1.0mm 硼硅酸盐玻璃毛细管（货号 #1B100F-3；World Precision Instruments Inc.）使用 Sutter p97 Flaming/Brown 微电极拉制仪（配备 2.5mm 灯丝）制备。
   2. 使用 2.5x4.5 mm 盒式灯丝（货号 FB245B，Sutter Instrument Co.）通过三步拉制程序制备注射针。本实验所用的程序参数如下表所示，但应根据每根灯丝进行优化。

      步骤 #	加热	拉力	速度	时间	压力
      1	740	100	8	250	500
      2	740	100	8	250	500
      3	740	100	10	250	500

      
      （升温温度 = 740）
4. 细胞准备
   1. 通常任何哺乳动物细胞系均可进行显微注射，但铺展良好的细胞类型更易于注射。细胞系的选择也可能取决于其他因素。例如，编码分泌蛋白的 mRNA 会靶向内质网表面，这一现象在 COS-7 细胞中比在 NIH 3T3 成纤维细胞中更为明显⁶（比较图 3 和图 4 中 t-ftz-Δi mRNA 的定位）。
   2. 显微注射前至少 24 小时，应将细胞接种于经酸洗的方形盖玻片（25x25mm）上，置于 30mm 培养皿中。在某些细胞系中，可通过将细胞接种于纤维连接蛋白包被的盖玻片上来促进细胞铺展^6,8。理想情况下，注射时细胞单层应达到约 70–90% 汇合度。
   3. 为便于识别已注射的细胞，可在注射前使用 200μl 塑料移液枪头在细胞单层上制造伤口。通常在盖玻片上划出十字形伤口（图 1），然后将细胞置于组织培养孵箱中恢复至少 15 分钟后再进行注射。
   4. 显微注射过程中，组织培养基会因 CO₂ 缓慢扩散而逐渐变为碱性。为维持注射期间的中性 pH，可在培养基中添加 10mM HEPES（pH 7.4）。额外的缓冲液可在显微注射前一天加入培养基中。
5. 显微镜与显微操作仪
   1. 使用倒置显微镜进行细胞显微注射，并将显微镜置于气浮平台上以减少可能干扰注射过程的振动。显微镜配备两个物镜：一个干式 10x 物镜，用于定位细胞和注射针；另一个干式 40x 超长工作距离相差物镜，用于观察显微注射过程。
   2. 若物镜带有校正环，则可消除因透过盖玻片和培养皿观察细胞所引起的光学像差。确保显微镜明场正确对准科勒照明⁹，也有助于校正因注射针散射光线引起的像差（见 2.2.4）。
   3. 注射针由三轴悬挂式操纵杆微操作装置（NT-88-V3MSH，Narishige）控制。粗调操作器固定在显微镜后支柱上，以便轻松将注射针上下移动进出培养皿，同时保持其原始位置。
   4. 注射针固定在一根连接至 5cc 玻璃注射器（货号 #512311；Becton Dickinson）的棒状装置上，该注射器提供必要的注射压力，使液体从显微注射针尖端排出。为控制压力水平，使用由两个堵头、一个管夹（可在任何五金店购买）和两个金属夹具组成的注射器调节器固定注射器筒和活塞（图 2）。为确保注射器维持高压，需在注射器活塞上涂抹真空脂（Dow Corning）。
6. 荧光杂交探针
   1. 使用 RNA 二级结构预测软件（如 RNAstructure 4.6¹⁰）对注射核酸的主序列进行折叠分析。
   2. 通过视觉评估 mRNA 的折叠结构，识别出一段约 50 个核苷酸、较少形成高熔解温度二级结构（如长双链）的区域。
   3. 合成该区域的反向互补序列，并在探针的 5' 端连接 Alexa546 荧光染料（可从 Integrated DNA Technologies 购买）。
   4. 将探针用水稀释至 100μM 浓度，并在 -80°C 保存 2–3 年。

2. 核内显微注射

1. 在显微注射显微镜上装载注射液
   1. 使用GELoader吸头（货号 # 022351656；Epindorff）从离心后的DNA或mRNA样品中吸取约1μl注射液。应从样品上层吸取液体，避免扰动含有颗粒物的沉淀，这些颗粒物可能堵塞注射针头。
   2. 将移液器吸头插入针头后端，并推出液体。液体将通过毛细作用被吸入针尖，通常在5–30秒内可在针尖附近观察到弯月面。
   3. 将充满液体的针头插入操作杆（wand）中，然后将其以45°角夹紧固定在显微操作器上。
   4. 使用10倍物镜观察针头，并利用粗调显微操作旋钮将其置于视野平面中央、接近焦平面的位置。随后将针头抬高几毫米，以防在后续步骤（2.2.2）中受损，然后将显微镜后支柱向后推回。
   5. 通过下压推杆0.5–2 cc来增加压力。
2. 显微注射
   1. 将含有带划痕单层细胞的盖玻片的培养皿放置于观察载物台上。
   2. 将显微镜后支柱向前拉至直立位置，使聚光镜对准光路，同时针头进入液体中。此操作应小心进行，以防针头触碰盖玻片而断裂（参见2.1.4）。
   3. 使用10倍物镜确定十字划痕中心位置，并将针头定位至待注射细胞上方。
   4. 切换至40倍物镜以提高放大倍数，并使用操纵杆上的微调旋钮降低并居中针头。若图像失焦，应确保入射光正确对中（即科勒照明⁹），可借助伯特兰透镜进行调整（参见1.5.2）。
   5. 注射应从伤口十字的一角开始，沿一条边缘连续进行，以便在观察时易于识别已注射的细胞（见图1）。
   6. 将针头降低至与细胞核接触。注射时相位亮度会发生明显变化，据此可清晰判断细胞是否已被成功注射。
   7. 若液体充满整个细胞，可能表明压力过高，需适当降低。
   8. 若未检测到相位亮度变化，可能说明显微注射压力不足以穿透细胞膜，或针尖发生堵塞。这可能是由多种因素引起，包括：压力不足、针头存在缺陷，或针尖被微小颗粒物堵塞。由于每次将针头装入显微操作器均耗时较长，且注射底物通常十分珍贵，因此提高可有效用于注射的针头比例至关重要。以下为逐步排除针尖堵塞问题的操作指南。每完成一步后，应尝试注射2–3个细胞，以评估堵塞是否已解除：

      	操作	目的与目标
      1	调节焦距以观察针尖全长。	判断针头是否存在明显缺陷，或是否有较大颗粒物堵塞针尖。
      2	将针尖置于培养皿中漂浮颗粒物旁。	若液体从针尖流出，应能扰动颗粒物，而无需针头直接接触。
      3	将注射器推杆完全压到底。	此瞬时增压应可清除针尖堵塞。释放推杆后，其应能自动回弹；若不能，则说明注射器内压力无法建立，需拧紧连接处和/或添加更多真空润滑脂。
      4	将针头从细胞培养液中提起。	将针头从水相介质中抽出的力有助于松动针尖堵塞物。
      5	将注射器推杆完全取出后重新插入。	此额外增压可能有助于清除针尖堵塞。
      6	用针尖在盖玻片干净区域轻轻刮擦。	进一步扰动针头内部颗粒物，帮助其重新定位以解除针尖堵塞。较强的刮擦可能使针尖末端崩裂，从而使堵塞物排出针外。
      7	更换新针头。

      
      
      另一个常见问题是针头内压力逐渐下降，需频繁下压注射器推杆以补偿。通常，在注射器推杆上添加更多真空润滑脂有助于维持更稳定的压力。但该问题也可能源于注射器与管路、管路与操作杆、或操作杆与针头之间的连接处存在漏气。大多数气漏可通过使用Parafilm（Fisher）或润滑脂密封解决，但操作杆与针头之间的漏气只能通过更换操作杆内的橡胶垫圈来修复。
   9. 沿伤口边缘对细胞进行显微注射，持续固定时间（10–15分钟）。经过练习，可在该时间段内完成数百个细胞的注射。
   10. 显微注射后，将细胞置于37°C组织培养孵育箱中孵育至所需时间后再进行固定。若注射的是DNA，可在20分钟后用含α-鹅膏蕈碱（1μg/ml；Sigma-Aldrich）的生长培养基处理细胞以终止转录。该浓度可有效抑制显微注射质粒的转录（见图3）。
   11. 同一根针头可重复用于多个盖玻片的注射，但在更换所注射的DNA或RNA类型时必须更换针头。一旦针头从操作杆上取下，应予以丢弃，不得再次使用。
   12. 死亡或漂浮的细胞偶尔会粘附在针尖上，干扰显微注射。为清除针尖上的此类碎片，可将支柱后推使针头离开液体，再将支柱调回直立位置，缓慢将针头重新插入液体中。
   13. 为准确测量mRNA核输出动力学，应在RNA显微注射后或α-鹅膏蕈碱处理后的0分钟、15分钟、30分钟、60分钟和120分钟分别固定独立的样品。

3. 细胞固定与染色

1. 细胞固定与通透
   1. 在适当时间，吸除培养基，用 2 ml PBS 溶液（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、2 mM KH₂PO₄，pH 7.4）将细胞洗涤两次。操作过程中应尽量减少盖玻片暴露于液体外的时间，以保持其湿润状态。
   2. 加入 2 ml 含 4% 多聚甲醛（Electron Microscope Sciences）的 PBS 溶液，在室温下固定细胞至少 15 分钟。
   3. 将固定后的样品用 PBS 溶液洗涤两次。
   4. 在室温下，用 2 ml 含 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液对细胞进行通透处理，至少持续 15 分钟。
   5. 样品再用 PBS 溶液洗涤两次。
2. FISH 染色
   1. 接下来需准备样品以进行杂交。用含 25–60% 甲酰胺的 1× SSC 溶液（150 mM NaCl、15 mM 柠檬酸钠，pH 7.0）将细胞洗涤两次。甲酰胺的浓度应与杂交溶液中的浓度一致（见 3.2.3）。
   2. 为制备染色室，将 150 mm 培养皿底部加水，并将一片 Parafilm 漂浮于水面。然后将培养皿倒置，使水流出，Parafilm 即可贴附于皿底。手动去除气泡。
   3. 对于每张待染色的盖玻片，将 100 μl 杂交溶液（含 25–60% 甲酰胺、100 mg/ml 硫酸葡聚糖、1 mg/ml E. coli tRNA、5 mM 钒酰核苷复合物的 1× SSC 溶液，并将探针稀释至 1:500）滴加至 Parafilm 上。注意，甲酰胺的浓度应根据所用 FISH 探针的具体要求进行优化。
   4. 使用镊子将盖玻片从 30 mm 培养皿中取出，用 Whatman 滤纸（VWR）吸干盖玻片背面（无细胞面），并从正面吸除多余缓冲液，但不得使固定细胞干燥。随后将盖玻片细胞面向下放置于 FISH 溶液液滴上。每张盖玻片均重复此操作。
   5. 将染色室盖子盖回后，样品在 37°C 下孵育 5–18 小时。
3. 染色样品的洗涤与封片
   1. 按照与染色室相同的方法制备多个洗涤室（见 3.2.2）。
   2. 对于每张盖玻片，将 1 ml 洗涤缓冲液（含 25–60% 甲酰胺的 1× SSC）滴加至洗涤室的 Parafilm 上。同样，甲酰胺浓度应与杂交溶液中的一致（见 3.2.3）。
   3. 为从染色室中取出盖玻片，将 1 ml 洗涤缓冲液滴加至盖玻片旁，通过毛细作用使液体渗入每张样品下方。
   4. 使用镊子将盖玻片取出，并逐一置于洗涤缓冲液液滴上，在室温下孵育 5 分钟。
   5. 重复步骤 3.3.2 至 3.3.4 两次，使每张盖玻片共洗涤三次。
   6. 若需通过免疫荧光共染 RNA 与某种蛋白，请参见第 3.4 节。
   7. 载玻片用 70% 乙醇洗涤，并用 Kimwipes 擦干。对于每张盖玻片，将 10–30 μl 含 DAPI 的封片液（Fluoromount G，Southern Biotech）滴加至载玻片上。每张载玻片可容纳两张盖玻片。
   8. 使用镊子和 Whatman 滤纸，吸干盖玻片背面，并从正面吸除多余液体，但不得使样品干燥。随后将每张盖玻片细胞面向下放置于封片液液滴上。
   9. 封片后的样品可于 4°C 保存。
4. 免疫荧光染色
   1. 样品需用 PBS 洗涤两次，以去除可能干扰抗体染色效果的甲酰胺。
   2. 对于每张盖玻片，将 50 μl 一抗溶液（含 1.0 μg/ml 抗体、0.1% TX-100、0.1 mg/ml 无 RNA 酶 BSA 的 PBS 溶液）滴加至洗涤室的 Parafilm 上。
   3. 使用镊子将盖玻片细胞面向下置于一抗溶液液滴上，在室温下孵育 30 分钟。
   4. 对于每张盖玻片，将两滴各 1 ml 的 PBS 溶液滴加至洗涤室的 Parafilm 上。
   5. 为从抗体染色液中取出盖玻片，将 1 ml PBS 滴加至盖玻片旁，通过毛细作用使液体渗入每张样品下方。
   6. 使用镊子将盖玻片取出，先置于第一滴 PBS 中 5 分钟，再转移至第二滴 PBS 中继续孵育 5 分钟。
   7. 使用荧光二抗溶液（含 1.0 μg/ml 抗体、0.1% TX-100、0.1 mg/ml BSA 的 PBS 溶液）重复步骤 3.4.2 至 3.4.6。注意，由于注射标记物和 RNA 分别在绿色和红色通道可见，二抗必须偶联合适的荧光染料，例如 Alexa647。
   8. 盖玻片按 3.3.7 步骤进行封片。

4. 成像与定量分析

1. 成像
   1. 使用落射荧光显微镜对注射后的细胞进行成像。通过定位十字形伤口并识别含有注射标记物（OG-葡聚糖）的细胞，可找到已注射的细胞。
   2. 对每个观察到的细胞，采集其注射的 OG-葡聚糖图像。在对显微注射的 mRNA 进行成像时，定量分析应仅限于那些将超过>90% 注射液体（即葡聚糖）注入细胞核的细胞。
   3. 随后采集 RNA 的图像。为了准确测量 RNA，同一时间序列中所有细胞的曝光时间应保持恒定，并处于相机的动态范围之内。理想情况下，每张图像应包含一个未注射的细胞，以便正确计算背景荧光强度（见 4.2.4）。
   4. 为便于定量分析，也可采集 DAPI 染色的图像。如果进行了免疫荧光染色，也可对所标记的蛋白质进行成像。图 4 展示了在不同时间点 mRNA 分布的示例。该 mRNA 编码一种分泌蛋白，因此在 COS-7 细胞中被靶向至内质网。请注意，通过将 RNA 与针对 TRAPα（一种定位于内质网的蛋白）的抗体共染色，已验证了其内质网靶向性¹¹。
2. 定量分析
   
   此步骤可通过多种不同的图像分析软件完成。ImageJ 软件非常适合用于定量分析细胞内 mRNA 的分布，因为它可用于手动分离核区与胞质区域，测量这些区域的平均荧光强度，且其输出数据可轻松复制并粘贴到其他软件（如 Microsoft Excel）中。
   1. 使用“图像堆栈”（Images to Stack）工具打开并合并对应于 FISH、OG-葡聚糖和 DAPI 荧光的图像。
   2. 在 DAPI 或葡聚糖图层中，使用“阈值”（Threshold）工具分离出对应于显微注射细胞核的区域。使用“魔棒”（Wand）工具选中该区域，然后切换至 FISH 图层，使用“测量”（Measure）工具记录该区域的面积（A_Nuc）和平均荧光强度（F_Nuc）。
   3. 使用“自由手选区”（Freehand selection）工具勾勒细胞轮廓，并在 FISH 图层上使用“测量”工具记录面积（A_Tot）和平均荧光强度（F_Tot）。如果细胞的荧光强度显著高于背景，可使用“阈值”工具代替“自由手选区”工具来勾勒目标细胞。
   4. 使用“矩形选区”（Rectangular selection）功能，在一个未注射的细胞上绘制方框，并记录其平均荧光强度（F_Back）。
   5. 将所有测量数据复制到 Excel 工作表中。
   6. 使用以下公式计算输出的 mRNA：
      
      

      ANuc	细胞核面积
      ATot	整个细胞的面积
      FNuc	核区平均荧光强度
      FTot	全细胞区域平均荧光强度
      FBack	未转染细胞的平均荧光强度

      
      对每个时间点计算平均 %输出值，并随时间绘制曲线。
   7. mRNA 稳定性通过绘制平均总 mRNA 荧光强度（A_Tot × (F_Tot - F_Back)）随时间的变化曲线来计算。通常我们发现，不同细胞之间以及不同盖玻片之间的 mRNA 量差异较大。这可能是由于注射针流速不一致以及 FISH 染色效率差异所致。

图1. 显微注射盖玻片。 细胞培养至70-90%融合度后，使用200μl塑料移液枪头在垂直和水平方向制造划痕。从十字形划痕处开始，沿其中一个划痕边缘（箭头所示）进行细胞显微注射。

图 2. 注射器调节器。A) 展示注射器调节器组装方式的流程图。B) 组装完成装置的示意图。C) 组装完成的注射器调节器照片。

图3. α-鹅膏蕈碱对注射质粒DNA转录的影响。 NIH3T3成纤维细胞经不同浓度α-鹅膏蕈碱预处理后，注射t-ftz-Δi质粒DNA和OG标记的70 kDa葡聚糖。注射后的细胞在37°C孵育1小时，随后固定，并使用特异性FISH探针6对t-ftz-Δi mRNA进行染色。每行对应一个视野，分别显示OG-70 kDa葡聚糖和t-ftz-Δi mRNA的成像结果。注意，高浓度药物完全抑制了t-ftz-Δi转录本的生成，而低浓度则无此效应。比例尺 = 15 μm。

图 4. mRNA 核输出的时间进程。 将 t-ftz-Δi 质粒 DNA 和 OG 标记的 70 kD 葡聚糖显微注射入 COS-7 细胞。注射后 30 分钟，用 α-鹅膏蕈碱处理细胞，并在 37°C 下孵育指定时间。随后固定细胞，并用针对 t-ftz-Δi mRNA 的探针以及针对内质网标志物 TRAPα 的抗体进行染色。每一行对应一个单独的细胞视野。A) 显微注射后不同时间点的 mRNA 分布情况。B) 图 (A) 中 120 分钟时间点的放大图像，显示 t-ftz-Δi mRNA 与内质网的共定位。右侧图显示 t-ftz-Δi mRNA（绿色）与 TRAPα（红色）染色的叠加图像。比例尺 = 15 μm。

讨论

显微注射是一种强大的工具，可用于研究多种不同的细胞过程。与传统的细胞转染不同，显微注射使研究人员能够在极短的时间内将核酸有效地导入细胞核内。因此，可以进行动力学分析，例如测定mRNA输出速率、mRNA定位以及蛋白质合成速率。此外，由于实验时间相对较短，可以在短时间内使细胞暴露于有毒化合物而不引发多效性效应。而且，抑制性或刺激性化合物（如显性负性蛋白）可与核酸共同注射。最后，显微注射避免了使用转染试剂的需求，而这些试剂通常对细胞具有毒性，并可能干扰不同的细胞功能。

mRNA 与质粒 DNA 注射

注射何种核酸取决于多种因素。在注射质粒DNA后，RNA聚合酶II不仅合成mRNA，还会募集蛋白质因子至新生转录本^12,13由于这些因素调控着mRNA加工、核输出和细胞质定位等事件，因此可通过质粒DNA注射来评估转录如何与下游过程相偶联。尽管转录可能与核输出相偶联¹⁴，我们发现注射的mRNA比 体内 转录的mRNA⁶目前尚不清楚其具体原因，但这一结果可能表明，新合成的mRNA在从RNA聚合酶II上释放后，可能被结合在某些复合物中，从而阻碍了其核输出。

mRNA注射具有一些优势。首先，研究人员无需使用RNA聚合酶抑制剂，这类抑制剂可能会影响细胞对RNA整体代谢的调控。其次，RNA可以进行修饰 体外 注射前。例如，可通过合成带有不同5'帽类似物或不同长度poly(A)尾的mRNA，以评估这些特征对核输出的影响⁶第三，所注射的 RNA 确切数量可进行粗略估计。根据上述方案，我们估计每个细胞核中大约注射了 20,000 至 50,000 个分子，与典型哺乳动物细胞中转录本的总数（400,000 至 850,000 个分子）相比，这一数量相对较少。¹⁵mRNA注射的主要缺点是在显微注射过程中，注射液不可避免地会部分泄漏到细胞质中。由于直接注入细胞质的mRNA在较长时间内保持稳定（A. Palazzo，未发表观察），因此必须格外谨慎地选择用于定量分析的细胞。通常我们分析那些接受 >通过OG-葡聚糖的分布评估，90%的注射液位于细胞核内。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
注射缓冲液	Sigma-Aldrich		140 mM KCl 和 10 mM HEPES，pH 7.4
Oregon Green 488-70kD 右旋糖酐	Invitrogen	D7173	在注射缓冲液中配制成 10 mg/ml 的储存液，可在 -80°C 长期保存
硼硅酸盐毛细管	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
用于填充注射针头的凝胶加样枪头	Eppendorf	022351656
显微镜	Nikon Instruments	Eclipse Ti-S
显微操作器	Narishige International	NT-88-V3MSH
注射用注射器	BD Biosciences	512311
PBS 缓冲液	Sigma-Aldrich		137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4
SSC 缓冲液	Sigma-Aldrich		150 mM NaCl, 15 mM 柠檬酸钠, pH 7.4
4% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15686	将 37% 多聚甲醛储存液用 PBS 稀释
0.1% Triton X-100（Surfact-Amps）	Thermo Fisher Scientific, Inc.	28314	将 10% Triton X-100 储存液用 PBS 稀释
甲酰胺	Fisher Scientific	F84-1
硫酸葡聚糖	Fisher Scientific	BP1585-100
E. coli tRNA	Sigma-Aldrich	R1753
钒酰核糖核苷复合物（VRC）	Sigma-Aldrich	R3380
Whatman 滤纸	VWR international	28298-020
防振台	Kinetic Systems	5702E-3036-21
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-20
α-鹅膏蕈碱	Sigma-Aldrich	A2263
Parafilm 封口膜	Fisher Scientific	13-374-12
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-97
真空润滑脂	Dow Corning	695400008
T7 RNA 聚合酶	New England Biolabs	M0251S
聚(A)聚合酶	Ambion	AM1350
杂交缓冲液	Sigma-Aldrich		100 mg/ml 硫酸葡聚糖, 5 mM VRC, 150 mM NaCl, 15 mM 柠檬酸钠, 0.5 mg/ml E. coli tRNA, 60% 甲酰胺