小鼠模型中脑池导管植入术

摘要

来源：Xavier, A. L. R., 等．啮齿类动物小脑延髓池插管植入．J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了将套管植入麻醉小鼠小脑延髓池的手术步骤。该技术包括将连接针头的套管穿过硬脑膜，插入倒三角形的小脑延髓池，并将其固定，以实现向脑脊液中靶向给药。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 手术步骤
   注意：慢性小脑延髓池（CM）插管术允许动物从手术中恢复。插管植入后次日进行CM注射，重要的是，该操作可在麻醉或清醒动物中进行。由于这是恢复性手术，所有操作均应在无菌条件下进行。
   1. 称量小鼠（C57BL/6JRj，两性均可，8周龄），并通过腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮和赛拉嗪混合物（分别为100 mg/kg和10 mg/kg）进行麻醉。如有必要，在手术过程中可追加半剂量氯胺酮（50 mg/kg）。或者，在慢性插管术中，可通过将小鼠置于2.5 - 3%异氟烷、约1 L/min氧气（O₂）的诱导室中进行麻醉。此时，术中应使用鼻罩维持1.5 - 2%异氟烷麻醉。
   2. 当脚趾夹捏反射消失且呼吸变得缓慢而稳定时，将动物置于加热垫上的立体定位仪中。
   3. 涂抹眼用软膏。手术过程中根据需要重复使用。
   4. 剃除小鼠头部和颈部毛发，清理皮肤，并先用酒精棉片消毒，再用氯己定（0.5%）或碘溶液（2%）消毒两次。重复此消毒步骤共四次。
      注意：剃毛后更换手术巾以清除碎屑和毛发，然后覆盖动物以保护无菌区域。
   5. 对于慢性插管术，在切口部位皮下注射（s.c.）利多卡因/布比卡因混合液（分别为1 mg/ml和0.25 mg/ml）0.5 - 1 ml。术后镇痛给予布伦诺啡（0.05 mg/kg；s.c.）。
   6. 将小鼠固定在立体定位仪上。确认固定牢固（通过耳杆或颧弓固定），轻微倾斜头部，使其与身体成120°角（图1E）。
   7. 找到颅骨在颈部肌肉上方突出的部分——枕骨嵴。用镊子提起其上方皮肤，沿中线剪下约1 cm大小的杏仁形皮肤。使用棉签或眼科探针控制任何出血。
   8. 以枕骨嵴为参考点，分开浅层结缔组织，暴露下方的颈部肌肉。
   9. 沿切口前后轴方向小心地用镊子沿中线分离肌肉。双手各持一把弯镊，将镊尖在颅底中线附近汇合，然后将肌肉向两侧拉开。
      注意：此操作应暴露小脑延髓池（CM），其呈微小倒三角形，上方为小脑，下方为延髓，位于半透明的硬脑膜后方（图1B和1C）。
   10. 使用外科眼科探针或棉签擦拭覆盖CM的硬脑膜。
2. 将插管插入CM
   1. 将插管从小鼠脑脊液（aCSF）填充的注射器中取出，保持30G针头连接在导管末端。
   2. 将30G针头连接至装有蒸馏水的100 µL注射器，该注射器连接至注射泵。
   3. 借助注射泵抽吸空气，在插管内引入约1 cm长的气泡。
   4. 使用注射泵将12 μL所需脑脊液（CSF）示踪剂吸入插管中。
   5. 用主手握持的弯头镊夹住充满CSF示踪剂的插管，靠近导管覆盖的针头部位。将非主手的中指抵住对侧耳杆并保持稳定，以便后续作为插管的支撑。
   6. 以相对于小鼠头部45°角将插管插入CM中心，该位置可通过硬脑膜下观察到的三角形轮廓识别。避免穿透小脑或延髓。确保针头插入深度仅为1 - 2 mm，即斜面完全进入硬脑膜下方即可。松开夹持插管的镊子，让插管 resting 在非主手上。
      注意：牙科针的斜面端需要施加一定力量才能刺穿覆盖CM的硬脑膜。
   7. 如有必要，使用外科眼科探针或棉签擦干穿刺后渗出的脑脊液。
   8. 在插管周围硬脑膜上滴加2-3滴氰基丙烯酸酯胶水。再滴加一滴胶水加速剂以立即固化胶水。用牙科水泥（约0.5 mg）与氰基丙烯酸酯胶水（3 - 5滴）的混合物覆盖颅骨和针头。随后立即滴加一滴胶水加速剂使其固化。

结果

图1：向小脑延髓池注射示踪剂。 (A小鼠头部与脑部示意图，显示小脑延髓池（CM）相对于脑部及颅骨结构的位置。 （B） 周围颈部肌肉经钝性分离并向两侧推开后，暴露的CM的显微照片。CB图中所示区域（黑色矩形）的高倍放大图像，显示CM的倒三角形结构（虚线）及...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SOPIRA 一次性注射针筒 30G 0.3 x 12 mm	Kulzer	AA001
氯己定 0.5%（氯己定二葡糖酸盐）	Meda AS		http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/
70% 酒精棉片，异丙醇，30 x 60 mm	Vitrex Medical A/S	520213
Viskoese Oejendraeber Ophtha	眼科	145250
木制涂抹棒，双头棉签Ø 约4-5毫米，长约12毫米	Heinz Herenz	1032018
眼刺	Medicom	A18005
Kimtech Science 精密擦拭纸巾	金伯利·克拉克专业版	5511
Loctite 超级胶水精密型 5 g	Loctite		http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html
Insta-Set CA 加速剂	Bob Smith Industries	BSI-152
牙科水泥粉	A-M Systems	525000
磷酸盐缓冲液（PBS；0.01 M；pH 7.4）	Sigma Aldrich	P3813
卵清蛋白，Alexa Fluor 647 标记物	赛默飞世尔科技	O34784
DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）溶液（1 mg/mL）	Thermo Fisher Scientific	62248
葡聚糖，荧光素，3000 道尔顿，阴离子	Thermo Fisher Scientific	D3305
Ketaminol Vet 100 mg/mL（氯胺酮）	Intervet International BV	511519
隆朋兽用 20 mg/mL（赛拉嗪）	KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH	148999
利多卡因 20 mg/mL（Xylocain）	阿斯利康	158543
Marcain 2.5 mg/mL（布比卡因）	阿斯利康	123918
布托啡诺 Vet 0.3 mg/mL（buprenorphine）	Richter Pharma AG	185159