将荧光标记的神经前体细胞注射至人脑类器官以建立移植模型

摘要

来源： Ibanez-Rios, M.I., 等一种人脑类器官神经细胞移植模型。 J. Vis. Exp. (2023)

本视频展示了使用细胞-基质混合物将荧光标记的神经前体细胞（NPCs）注射到人脑类器官中的过程。该方法可重复且无需使用动物，能够实现对类器官结构最小干扰的移植操作。该技术为神经移植及中枢神经系统（CNS）疾病建模提供了有价值的实验平台。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 将标记细胞注射到脑类器官中

注意： 本研究中，脑类器官是根据生产商说明书使用商业试剂盒制备的。此步骤可替换为感兴趣的脑类器官。本方案此部分所用材料必须预先冷却，以避免可溶性基底膜基质在高于 4 °C 的温度下发生凝胶化。

1. 将接触溶解后基底膜基质的胰岛素注射器、枪头和离心管置于 −20 °C 冷却。
2. 在冰上解冻适量的溶解基底膜基质，具体体积取决于将要进行的注射次数（约每注射2 μL）。此过程大约需要30分钟。
3. 在 aliquot 解冻的同时，对细胞进行传代、收集并计数。
4. 计算每次注射所需的体积。若进行多次注射，将细胞的总体积置于1.5 mL离心管中，并加入最多1 mL的DMEM/F12。
   注意： 应使用稍大一些的体积，以弥补损失或移液误差导致的额外注射需求。
5. 将细胞置于冰上，同时准备下一步操作。
6. 解冻后，将溶解的基底膜基质用预冷的 DMEM/F12 稀释至终浓度为 3 mg/mL。
7. 从冰上取下单细胞悬液，在 4 °C 条件下于 300 × g 离心 5 分钟。
   注意： 若无冷藏离心机，通常可在室温下离心，一般可耐受。
8. 轻轻完全移除培养基，注意不要扰动细胞沉淀。用移液枪轻柔吹打，将细胞沉淀重悬于稀释的可溶性基底膜基质（3 mg/mL）中，每注射点终体积为2 μL，并立即置于冰上保存直至使用。
   注意： 细胞重悬过程需缓慢进行，并使用预冷的枪头，以避免产生气泡和凝胶化现象。
9. 将预冷的注射器从−20 °C冰箱转移至装有冰的冰桶中，存放直至使用。
10. 将装有脑类器官的培养板从培养箱中取出。使用宽口吸头将待注射的类器官转移至35 mm培养皿中。移除尽可能多的培养基，注意不要损伤类器官，以稳定其位置并便于注射。
    注意： 使用宽孔枪头以避免破坏类器官非常重要。如果无法获得宽孔枪头，可用无菌剪刀剪去普通P1,000枪头的尖端。
11. 将含有类器官的35 mm培养皿置于解剖显微镜下，以辅助和引导注射操作。
    注意： 如果无菌区域没有体视显微镜，也可以在无显微镜的情况下进行注射操作，但控制精度会有所降低。另一种替代方案是使用放大头戴镜或放大眼镜。
12. 当类器官准备就绪可用于注射时，用预冷的P20枪头轻轻重悬细胞，并将2 μL（含有预定注射细胞数量）转移至预冷的无菌玻璃载片上。
    注意： 对于多次注射，可在玻片上额外添加 2 μL 体积的样品。保持样品在冰上，并注意避免蒸发。
13. 从冰上取一支预冷的胰岛素注射器，将针头斜面朝下，缓慢吸取2 μL细胞悬液，以确保所有细胞/培养基被完全吸入。
    注意： 务必极其缓慢地操作，以避免吸入任何空气。
14. 打开含有类器官的培养皿盖子，将显微镜对准类器官。一只手握住培养皿，另一只手将针头斜面朝上，缓慢将细胞注入类器官表面。
    注意： 缓慢注射至关重要，以避免损伤组织。
15. 注射后，将盖子放回培养皿中，让注射后的类器官静置1-2分钟。
    注意： 这使得稀释后的可溶性基底膜基质得以凝胶化，从而将细胞固定在原位。如果过早加入培养基，可能会冲走附着在表面的细胞。
16. 轻轻加入 500 μL 类器官培养基，用宽口枪头将类器官转移至 24 孔板的一个孔中。在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养类器官₂ 过夜。每隔一天完全更换培养基。
    注意： 需要设置一个阴性对照类器官（模拟注射），用于成像参数的调整。具体操作如下：按照前述方法，将稀释后的可溶性基底膜基质（3 mg/mL）注射到一个类器官中，总体积为 2 μL，不加入细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM F12/Glutamax	Thermo	10565018
基底膜基质（生长因子减少型，GFR）	Corning	356231	无酚红，无LDEV