利用神经球实验分离与扩增成年小鼠神经干细胞

摘要

本视频方案演示了从成年小鼠脑室周围区域分离和扩增神经干细胞的神经球实验方法，并提供了技术要点，以确保获得可重复的神经球培养结果。

摘要

从成年小鼠脑组织中分离并扩增神经干细胞（NSCs）的方法最早由Reynolds和Weiss于1992年报道，该方法采用一种化学成分明确且无血清的培养体系，称为神经球检测法（neurosphere assay, NSA）。在此体系中，大多数已分化细胞类型在培养数天后死亡，而少数对生长因子有响应的前体细胞则在表皮生长因子（EGF）和/或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）存在条件下活跃增殖。这些细胞形成未分化细胞的克隆集落，称为神经球，神经球可进一步传代培养以扩增神经干细胞群体。此外，这些细胞可被诱导分化，生成中枢神经系统（CNS）的三大主要细胞类型，即神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。该检测法为获得稳定、可再生的未分化中枢神经系统前体细胞提供了极为宝贵的工具，可用于 体外 研究以及治疗目的。

本视频演示了利用NSA方法从成年小鼠脑室周围区域分离和扩增神经干细胞（NSCs）的技术，并提供了确保获得可重复性神经球培养的关键技术要点。该操作流程包括从成年小鼠体内取出大脑，显微解剖脑室周围区域，组织制备，并在NSA中进行培养。所获取的组织首先使用胰蛋白酶-EDTA进行化学消化，随后在NSC培养基中通过机械法解离，以获得单细胞悬液，最终接种于NSA中。培养7至10天后，获得的原代神经球即可进行传代培养，以扩增至后续实验所需的细胞数量。

方案

第1部分：开始解剖前的基本准备：

1. 通过将 NeuroCult NSC 基础培养基与 NeuroCult NSC 增殖添加剂按 9:1 的比例混合，配制适量体积的完全 NSC 培养基。也可根据文献中公布的 NSC 生长培养基成分在实验室自行配制 NSC 培养基¹。如果您的实验室在培养基配制方面经验不足，我们强烈建议使用 commercially available medium（商品化培养基），该培养基在出售前已针对 NSC 的生长进行了质量控制（例如 NeuroCult，Stem Cell Technologies）。
2. 将培养基置于 37°C 水浴中预热。
3. 为解剖和清洗操作，配制含高浓度抗生素（10%）的冷 HEPES 缓冲最低必需培养基（HEM）。或者，也可使用添加抗生素的 NSC 基础培养基用于此目的。
4. 将含抗生素的 30–40 ml 冷 HEM 分装至无菌 50 ml 离心管中，用于脑组织采集。
5. 需要若干个 10 cm 塑料培养皿用于解剖过程中放置脑组织，另需一个 10 cm 无菌玻璃培养皿用于盛放已解剖的组织。
6. 用于取出脑组织的手术器械（大剪刀、小尖头剪刀、大镊子、小弯头镊子和小刮勺）或用于组织解剖的器械（小镊子、弯头精细镊子和手术刀）需使用玻璃珠灭菌器在 250°C 下灭菌，或采用其他可用的高压灭菌方法进行灭菌。
7. 解剖显微镜用 70% 酒精擦拭，并置于生物....

讨论

神经球实验 ² 在科研领域已受到广泛关注，不仅用于从中枢神经系统（CNS）^4-5 分离和研究神经干细胞（NSCs），还用于从多种组织（如乳腺 ⁶ 和心脏 ⁷）中分离其他类型的假定干细胞，并用于鉴定脑、乳腺和结肠肿瘤干细胞 ^8-9，表明该培养体系可应用于全身多种体细胞及肿瘤前体细胞群体。该方法的一些优势包括操作简便、可重复性强，以及能够在化学成分明确且无血清的培养基中，从少量组织甚至少量细胞扩增出数量无限的细胞。

需要强调的是，培养物中神经球的数量并不能代表干细胞的数量，因为神经球既可以来源于真正的干细胞，也可以来源于更局限的前体细胞¹⁰。为此，已建立一种检测方法，用于准确计数培养物中的神经干细胞¹¹。

用于将神经球解离为单细胞悬液的方法包括机械法和酶解法。尽管机械法是最初的神经球解离方法²，但该方法需要丰富的操作经验，且其效率因操作者而异。如果由经验.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NeuroCult NSC 基础培养基	培养基	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC 增殖添加剂	培养基添加剂	Stem Cell Technologies	05701
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	试剂	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
大豆胰蛋白酶抑制剂	试剂	Sigma-Aldrich	T6522
细胞筛	筛具	BD Biosciences	352340
T25 培养瓶	培养器皿	Nalge Nunc international	136196
T80 培养瓶	培养器皿	Nalge Nunc international	178905
EGF	生长因子	R&D Systems	2028-EG
青霉素-链霉素（Pen/Strep）	试剂	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
*MEM	试剂	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	HEM 组分
*HEPES	试剂	Sigma-Aldrich	H4034	HEM 组分
*蒸馏水	试剂	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
15 ml 离心管	培养器皿	BD Biosciences	352096
50 ml 离心管	培养器皿	BD Biosciences	352070
精细弯镊	手术工具	Fine Science Tools	11251‐35
小型精细镊	手术工具	Fine Science Tools	11272‐30
小型镊子	手术工具	Fine Science Tools	11050‐10
b-FGF	生长因子	R&D Systems	3139-FB
肝素	生长因子	Sigma-Aldrich	H4784	用 PBS 重悬
*配制 HEM：取 1×10 L 的 MEM 粉剂包与 160 ml 的 1 M HEPES 混合，用蒸馏水定容至 8.75 L，调节最终 pH 至 7.4，并于 4°C 保存。