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方法文章

利用神经球实验分离与扩增成年小鼠神经干细胞

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DOI：

10.3791/2393

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2010年11月20日

 ,  ,  , 
1 Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran , 2Department of Neurosurgery, University of Florida

本文内容

摘要

本视频方案演示了从成年小鼠脑室周围区域分离和扩增神经干细胞的神经球实验方法，并提供了技术要点，以确保获得可重复的神经球培养结果。

摘要

从成年小鼠脑组织中分离并扩增神经干细胞（NSCs）的方法最早由Reynolds和Weiss于1992年报道，该方法采用一种化学成分明确且无血清的培养体系，称为神经球检测法（neurosphere assay, NSA）。在此体系中，大多数已分化细胞类型在培养数天后死亡，而少数对生长因子有响应的前体细胞则在表皮生长因子（EGF）和/或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）存在条件下活跃增殖。这些细胞形成未分化细胞的克隆集落，称为神经球，神经球可进一步传代培养以扩增神经干细胞群体。此外，这些细胞可被诱导分化，生成中枢神经系统（CNS）的三大主要细胞类型，即神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。该检测法为获得稳定、可再生的未分化中枢神经系统前体细胞提供了极为宝贵的工具，可用于 体外 研究以及治疗目的。

本视频演示了利用NSA方法从成年小鼠脑室周围区域分离和扩增神经干细胞（NSCs）的技术，并提供了确保获得可重复性神经球培养的关键技术要点。该操作流程包括从成年小鼠体内取出大脑，显微解剖脑室周围区域，组织制备，并在NSA中进行培养。所获取的组织首先使用胰蛋白酶-EDTA进行化学消化，随后在NSC培养基中通过机械法解离，以获得单细胞悬液，最终接种于NSA中。培养7至10天后，获得的原代神经球即可进行传代培养，以扩增至后续实验所需的细胞数量。

方案

第1部分：开始解剖前的基本准备：

  1. 通过将 NeuroCult NSC 基础培养基与 NeuroCult NSC 增殖添加剂按 9:1 的比例混合，配制适量体积的完全 NSC 培养基。也可根据文献中公布的 NSC 生长培养基成分在实验室自行配制 NSC 培养基1。如果您的实验室在培养基配制方面经验不足，我们强烈建议使用 commercially available medium（商品化培养基），该培养基在出售前已针对 NSC 的生长进行了质量控制（例如 NeuroCult，Stem Cell Technologies）。
  2. 将培养基置于 37°C 水浴中预热。
  3. 为解剖和清洗操作，配制含高浓度抗生素（10%）的冷 HEPES 缓冲最低必需培养基（HEM）。或者，也可使用添加抗生素的 NSC 基础培养基用于此目的。
  4. 将含抗生素的 30–40 ml 冷 HEM 分装至无菌 50 ml 离心管中，用于脑组织采集。
  5. 需要若干个 10 cm 塑料培养皿用于解剖过程中放置脑组织，另需一个 10 cm 无菌玻璃培养皿用于盛放已解剖的组织。
  6. 用于取出脑组织的手术器械（大剪刀、小尖头剪刀、大镊子、小弯头镊子和小刮勺）或用于组织解剖的器械（小镊子、弯头精细镊子和手术刀）需使用玻璃珠灭菌器在 250°C 下灭菌，或采用其他可用的高压灭菌方法进行灭菌。
  7. 解剖显微镜用 70% 酒精擦拭，并置于生物安全柜（PC2 柜）内准备就绪。

第二部分：成年小鼠脑组织的采集与显微解剖：

  1. 根据所在机构批准的动物实验方案，使用 3-4% 异氟烷麻醉或腹腔注射戊巴比妥钠（120 mg/kg），对 2-4 只成年（5-8 周龄）小鼠进行麻醉。
  2. 实施颈椎脱位以确保动物不会遭受疼痛与痛苦。
  3. 将麻醉后的小鼠俯卧于吸水纸巾上，并用 70% 乙醇冲洗头部以消毒操作区域。
  4. 使用大剪刀在颈脊髓区域稍上方处剪断头部以进行去头。
  5. 使用小尖头剪刀沿中线从尾侧向头侧剪开皮肤，暴露颅骨。
  6. 利用切开的皮肤边缘固定头部，将小剪刀的两个刀片分别插入两侧眼眶，于两眼之间做冠状切口。
  7. 以枕骨大孔为入口，沿矢状缝做一条纵向切口，并在颅底与侧壁交界处做两条侧向切口。操作时应谨慎，通过做小切口并尽可能保持刀片角度平缓，避免损伤下方脑组织。
  8. 用弯头镊子夹住覆盖半球的颅骨，向外剥离以暴露脑组织；然后用湿润的小刮匙将脑组织转移至含有 HEM 的 50 ml 离心管中。
  9. 重复此操作，直至所有脑组织均被取出。
  10. 将脑组织转移至 PC2 生物安全柜中，用足量冷的无菌 HEM 洗涤三次，以去除可能的污染物（如血液和毛发）。随后将脑组织转移至含有 HEM 的 10 cm 培养皿中。
  11. 为分离前脑室周区域，将盛有脑组织的培养皿置于解剖显微镜下，调节至低倍放大。将脑组织腹面朝下平放，并用精细弯头镊子从尾侧固定。使用另一把弯头镊子去除嗅球。
  12. 去除嗅球后，将脑组织旋转以暴露其腹面。
  13. 在视交叉水平处做 90° 冠状切口，弃去脑组织的尾侧部分。
  14. 重复此操作，直至所有脑组织均被切段。
  15. 在较高倍镜下，将脑组织的头侧部分旋转，使切面朝上。首先使用精细弯头显微剪刀或弯头尖镊子去除并弃去隔区；然后切下侧脑室侧壁周围的一层薄组织，避免包括纹状体实质和胼胝体。将分离的组织收集至一个 10 cm 无菌玻璃培养皿中。
  16. 重复此操作，直至所有脑组织完成显微解剖。

第3部分：组织准备与细胞接种：

  1. 使用手术刀片将混合组织切碎约1-2分钟，直至仅剩微小碎片。
  2. 总共使用3 ml的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，将所有切碎的组织转移至一个15 ml离心管中。3 ml胰蛋白酶-EDTA足以良好消化来自最多8只小鼠的组织样本。
  3. 将离心管置于37°C水浴中孵育7分钟。
  4. 酶解孵育结束后，将离心管移回生物安全柜，并加入等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂以终止胰蛋白酶活性。
  5. 用移液器反复吹打悬浮液以确保胰蛋白酶完全失活，随后在700 rpm（110 g）条件下离心5分钟，使细胞沉淀。
  6. 弃去上清液，将组织碎片重悬于150 μl无菌NSC基础培养基中。将移液器重新设定为200 μl，轻柔地反复吹打（3-7次），直至形成均匀乳白色的单细胞悬液。吹打次数取决于切碎组织中颗粒的大小（建议将组织切得尽可能细小，以增加胰蛋白酶作用的表面积）。过度或剧烈的机械解离可能导致神经干细胞和前体细胞死亡，从而降低神经球的形成能力。
  7. 为去除碎片及未解离的组织块，向解离后的细胞悬液中加入NSC基础培养基，使总体积达到10-15 ml。将细胞悬液通过40 μm细胞滤网过滤至合适大小的离心管中，然后在700 rpm（110 g）条件下离心5分钟，收集细胞沉淀。
  8. 为进一步去除残留碎片，建议将沉淀重悬于10-15 ml NSC培养基中，并在700 rpm（110 g）条件下再次离心5分钟。
  9. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于适量完全NSC培养基中，该培养基需补充20 ng/ml EGF、10 ng/ml bFGF以及1 μl/ml的0.2%肝素。
  10. 将一只小鼠脑组织解离所得细胞接种至一个T25培养瓶中（含5 ml完全培养基）。将细胞置于37°C、5% CO2条件下培养7-10天，期间应形成神经球。通常，一只小鼠脑组织可生成400-600个神经球。

第4部分：神经干细胞的传代与扩增：

  1. 当神经球准备进行传代培养时（直径为 150–200 μm），将含有悬浮球体的培养基从培养瓶中移出，转移至适当大小的无菌组织培养管中，在室温下以 700 rpm（110 g）离心 5 分钟。
  2. 弃去上清液，将神经球重悬于 1 ml 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液中。或者，也可采用文献中描述的机械解离或化学解离方法对神经球进行传代2,3。
  3. 将细胞悬液置于 37°C 水浴中孵育 2–3 分钟，然后加入等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂以终止胰蛋白酶活性。
  4. 轻轻吹打细胞悬液，上下混匀，确保胰蛋白酶已完全失活。
  5. 将细胞悬液以 700 rpm 离心 5 分钟，弃去上清液后，将细胞重悬于 1 ml NSC 培养基中。
  6. 取 10 μl 细胞悬液与 90 μl 台盼蓝混合，进行细胞计数。
  7. 将细胞以 5×104 个细胞/ml 的密度接种于完全 NSC 培养基中，培养基中需添加 20 ng/ml EGF、10 ng/ml bFGF 和 1 μl/ml 的 0.2% 肝素。T25 培养瓶使用 5 ml 培养基，T75 培养瓶使用 20 ml，T175 培养瓶使用 40 ml。
  8. 在 37°C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育 5–7 天后，可形成次级神经球。

第5部分：代表性结果：

在成年人大脑原代神经干细胞培养中，大多数细胞在2-3天后会死亡，但对生长因子有反应的前体细胞（包括干细胞和祖细胞）将增殖（图1），并在6-8天后形成未分化细胞集落。在这些培养物中，通常存在大量碎片，这些碎片可能呈球形，易与神经球混淆。碎片的多少直接取决于显微解剖和组织处理技术。真正的神经球在相差显微镜下呈亮相（透亮），且随着体积增大而变得更加圆整（见视频）。培养7-10天后，神经球应呈圆形但不致密，直径应在150至200 μm之间，在高倍镜下观察时边缘应具有刚性的微突起（图2）。若神经球生长过大，其中心区域的细胞会发生死亡，导致整体颜色变暗。过大的神经球难以解离，最终会贴壁并开始分化。

细胞分裂过程的显微镜图像；聚焦有丝分裂活性；四联图示。
图1. 原代成体NSC培养物在接种后3天的形态。箭头所示为增殖性NSC的小克隆。原始放大倍数：20x。

类球体形成；显微镜图像；三维细胞培养；癌症研究；细胞结构研究。
图2. 接种后7天的成年神经球传代情况。注意球体边缘的微突起。原始放大倍数：20x。

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讨论

神经球实验 2 在科研领域已受到广泛关注，不仅用于从中枢神经系统（CNS）4-5 分离和研究神经干细胞（NSCs），还用于从多种组织（如乳腺 6 和心脏 7）中分离其他类型的假定干细胞，并用于鉴定脑、乳腺和结肠肿瘤干细胞 8-9，表明该培养体系可应用于全身多种体细胞及肿瘤前体细胞群体。该方法的一些优势包括操作简便、可重复性强，以及能够在化学成分明确且无血清的培养基中，从少量组织甚至少量细胞扩增出数量无限的细胞。

需要强调的是，培养物中神经球的数量并不能代表干细胞的数量，因为神经球既可以来源于真正的干细胞，也可以来源于更局限的前体细胞10。为此，已建立一种检测方法，用于准确计数培养物中的神经干细胞11。

用于将神经球解离为单细胞悬液的方法包括机械法和酶解法。尽管机械法是最初的神经球解离方法2，但该方法需要丰富的操作经验，且其效率因操作者而异。如果由经验...

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致谢

本工作获得了奥弗斯特里特基金会的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NeuroCult NSC 基础培养基培养基Stem Cell Technologies05700
NeuroCult NSC 增殖添加剂培养基添加剂Stem Cell Technologies05701
0.05% 胰蛋白酶-EDTA试剂GIBCO, by Life Technologies25300-062
大豆胰蛋白酶抑制剂试剂Sigma-AldrichT6522
细胞筛筛具BD Biosciences352340
T25 培养瓶培养器皿Nalge Nunc international136196
T80 培养瓶培养器皿Nalge Nunc international178905
EGF生长因子R&D Systems2028-EG
青霉素-链霉素（Pen/Strep）试剂GIBCO, by Life Technologies15140-122
*MEM试剂GIBCO, by Life Technologies41500-018HEM 组分
*HEPES试剂Sigma-AldrichH4034HEM 组分
*蒸馏水试剂GIBCO, by Life Technologies15230-147
15 ml 离心管培养器皿BD Biosciences352096
50 ml 离心管培养器皿BD Biosciences352070
精细弯镊手术工具Fine Science Tools11251‐35
小型精细镊手术工具Fine Science Tools11272‐30
小型镊子手术工具Fine Science Tools11050‐10
b-FGF生长因子R&D Systems3139-FB
肝素生长因子Sigma-AldrichH4784用 PBS 重悬

*配制 HEM：取 1×10 L 的 MEM 粉剂包与 160 ml 的 1 M HEPES 混合，用蒸馏水定容至 8.75 L，调节最终 pH 至 7.4，并于 4°C 保存。

参考文献

  1. Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  3. Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
  4. Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
  5. Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
  6. Dontu, G. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
  7. Messina, E. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
  8. Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
  9. Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
  10. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  11. Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).

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