使用硫黄素 T 荧光定量细菌感染诱导的淀粉样蛋白

摘要

资料来源： Balczon， R. 等人。铜 绿假单胞菌感染肺内皮细胞后细胞毒性淀粉样蛋白的检测方法。 J. Vis. Exp. （2018年）

该视频演示了使用硫黄素T（一种与淀粉样蛋白β折叠结构结合的荧光染料）定量被毒细菌感染的肺内皮细胞培养上清液中淀粉样蛋白的方案。与基线相比，荧光增加表明培养上清液中存在淀粉样蛋白。

方案

1. 细胞毒性上清液的分析

1. 要进行硫黄素 T （ThT） 测定，请使用 ThT 荧光定量上清液中的淀粉样蛋白。对于这些测量，请使用过滤灭菌的上清液。
   1. 通过将 8 mg ThT 悬浮在 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中来制备 ThT 储备溶液 （50x）。混合后，通过0.22μm过滤器过滤溶液以去除颗粒。
   2. 为了进行测量，将 20 μL ThT 储备液添加到 1 mL 分光光度计比色皿中的 1 mL PBS 中。将稀释的样品放入荧光光谱仪中。
   3. 使用 425 nm 激发测量基线荧光发射，并以 2 nm 的增量扫描 450-575 nm 的荧光发射。
   4. 使用 425 nm 激发和 482 nm 发射执行延时扫描，每 0.2 秒采集一次数据，持续 60 秒。
   5. 延时扫描的最初 20 秒测量空白比色皿中的荧光。在 20 秒时，暂停扫描并将 10 μL 过滤灭菌的上清液添加到比色皿中。倒置混合比色皿，然后将其放回荧光光谱仪中。
   6. 恢复基于时间的扫描，获取最后 40 秒的数据。
   7. 延时扫描完成后，使用相同的设置执行最终的荧光发射光谱扫描，如步骤 1.3 中所述。

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材料