利用硫黄素T荧光定量细菌感染诱导的淀粉样蛋白

摘要

来源： Balczon, R., 等检测肺内皮细胞感染后细胞毒性淀粉样蛋白的方法 铜绿假单胞菌. 视频实验杂志 (2018)

本视频演示了使用硫黄素T（一种可结合淀粉样β片层结构的荧光染料）定量检测感染了致病菌的肺内皮细胞培养上清液中淀粉样蛋白的实验方案。与基线相比，荧光信号的增加表明培养上清液中存在淀粉样蛋白。

方案

1. 细胞毒性上清液的分析

1. 进行硫黄素T（ThT）检测时，利用ThT荧光定量上清液中的淀粉样蛋白。进行这些测量时，使用滤膜除菌的上清液。
   1. 通过将8 mg ThT溶于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制ThT储存液（50倍浓度）。混合后，经0.22 µm滤膜过滤，以去除颗粒物。
   2. 进行测量时，在1 mL分光光度计比色皿中加入20 µL ThT储存液和1 mL PBS。将稀释后的样品放入荧光分光光度计中。
   3. 使用425 nm激发光，以2 nm步长扫描450–575 nm范围内的荧光发射，测定基线荧光发射。
   4. 进行时间推移扫描，激发波长为425 nm，发射波长为482 nm，每0.2 s采集一次数据，持续60 s。
   5. 时间推移扫描的前20 s用于测定空白比色皿中的荧光。在20 s时暂停扫描，向比色皿中加入10 µL滤膜除菌的上清液。通过倒置混匀比色皿，然后将其重新放回荧光分光光度计中。
   6. 继续时间推移扫描，采集最后40 s的数据。
   7. 时间推移扫描完成后，按照步骤1.3所述的相同设置，进行最终的荧光发射光谱扫描。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硫黄素T	Sigma Aldrich	T3516
PBS	Gibco	10010-023
0.22微米注射器滤器	Millipore	SLGP033RS