将目的基因导入细胞是阐明其在体内功能的一种强大方法。本方案描述了一种利用Amaxa公司生产的Nucleofector电穿孔装置转染人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）培养物的高效方法。
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本文内容
摘要
摘要
转染原代哺乳动物神经细胞（如人神经干细胞/前体细胞，hNSPCs）时，使用常规阳离子脂质转染试剂常导致细胞存活率低且转染效率不佳。其他将目的基因导入细胞的物理方法，如“基因枪”或显微注射，也受限于细胞存活率低以及转染细胞数量少的问题。利用病毒载体将外源基因导入原代细胞的策略，则受到构建病毒载体所需时间长、劳动强度大以及潜在安全问题的限制。本文介绍一种使用Amaxa公司的Nucleofector电转染装置和技术对hNSPCs进行转染的逐步操作方案，该方案所采用的电脉冲参数和缓冲液体系均针对神经干细胞的转染进行了专门优化。使用本方案，我们实现了约35%的初始转染效率，并在稳定转染后达到约70%的效率。该方案包括：将大量hNSPCs与待转染的DNA在适当的缓冲液中混合，随后使用Nucleofector装置进行电穿孔。
方案
注意：请参考 Passaging Human Neural Stem Cells 文章（https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263）和 Counting Human Neural Stem Cells 文章（https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262），了解如何重悬和计数 hNSPCs。
准备
- 确保有足够数量的细胞可用于转染（每种待转染的 DNA 需要数百万个细胞）。
- 在转染前一天晚上，用 10 µg/ml 人纤维连接蛋白包被组织培养皿，用于接种转染后的细胞。在开始转染实验前，移除纤维连接蛋白，用 PBS 清洗培养皿，并向其中加入培养基。将培养皿放入 37°C 组织培养孵箱中以预热培养基。同时，另取 1 ml 培养基放入孵箱中预热至 37°C。
- 将待转染的 DNA 以及转染溶液（来自 Amaxa）置于冰上。
转染
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讨论
本方案描述了一种相对快速且高效的hNSPCs转染方法。采用此方法，我们获得的初始转染效率约为35%。通过该程序转染的细胞可用于短期研究（瞬时转染细胞），或在使用筛选剂以建立稳定转染细胞群体的情况下用于长期研究。我们已成功获得稳定转染的细胞，其中约70%的细胞表达外源蛋白。在瞬时转染的hNSPCs中，我们观察到外源蛋白的表达可持续约7天。
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致谢
作者谨此感谢橙县研究学院儿童医院国家人类神经干细胞资源中心的 Philip H. Schwartz 博士提供 hNSPC 培养物。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 核转染装置 | 工具 | Amaxa | AAD-1001 | |
| 小鼠神经干细胞核转染试剂盒 | 试剂 | Amaxa | VPG-1004 |
参考文献
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A.
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重印与许可
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