研究细菌菌株间竞争相互作用的共培养实验

摘要

来源： Speare, L., et al. 用于量化Vibrio fischeri 分离株之间竞争相互作用的共培养实验。J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了一种共孵育实验方法，用于研究细菌菌株在共享环境中相互竞争的方式。该方法在微生物学中广泛应用，可用于鉴定驱动这些相互作用的机制，例如依赖接触或不依赖接触的杀伤机制。

方案

1. 共培养菌株（图1B，C）
   1. 将参考菌株与竞争菌株按1:1（v/v）比例混合，即分别取100 μL已调至OD 1.0的两种菌液，加入已标记的1.5 mL离心管中。作为对照，将参考菌株与其带有不同标签的同源菌株混合（参考菌株pVSV102 + 参考菌株pVSV208）。该对照对于后续的统计分析是必需的，用于确定竞争菌株的存在是否影响参考菌株的生长。将混合菌液涡旋振荡1–2秒。
      注意：此步骤可能需要优化，因为起始比例会显著影响实验结果，可能需要进行调整。
   2. 对每个生物学重复样本重复步骤1。完成此步骤后，应共有八个混合菌株管：四个为带有不同标签的参考菌株的生物学重复（对照），以及四个为带有不同标签的参考菌株与竞争菌株的生物学重复（实验组）。
   3. 将每种对照和实验混合液各取10 μL点样于含LBS琼脂的培养皿上；这些菌斑将在孵育后用于荧光显微镜观察。
   4. 将菌斑在实验台上静置至完全干燥，确保所有液体均被琼脂吸收，随后将培养皿置于24 °C条件下孵育24小时。对于使用pVSV102和pVSV208质粒标记的V. fischeri菌株，至少需要15小时的孵育时间，才能使细胞密度达到可在群体水平上通过荧光解剖显微镜分别观察到绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）的水平。本实验采用24小时孵育以进行混合菌斑的成像。
      注意：应使用湿度适中的平板，避免过湿或过干。若平板过湿，共培养菌斑将无法被琼脂吸收；应避免使用当天倒制的平板。若平板过干，琼脂表面可能出现细小波纹或裂纹，导致共培养菌斑形状不规则。

结果

图1：共孵育实验流程图。 (A) 分别携带pVSV102（参考菌株，记为Ref. Strain或R.S.）或pVSV208（竞争菌株，记为Comp. Strain或C.S.）的细菌菌株在选择性培养基上分别培养，参考菌株使用LBS Kan培养基，竞争菌株使用LBS Cam培养基。随后将菌株重悬于LBS液体...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Fisher	05-408-129
10 μL 多通道移液器
100 μL 多通道移液器
300 μL 多通道移液器
10 μL 单通道移液器
20 μL 单通道移液器
200 μL 单通道移液器
1000 μL 单通道移液器
24 孔板	Fisher	07-200-84	带盖无菌
培养皿	Fisher	FB0875713	带盖无菌
TipOne 0.1-10 μL 起始系统	USA Scientific	1111-3500	10 架
TipOne 200 μL 起始系统	USA Scientific	1111-500	10 架
TipOne 1000 μL 起始系统	USA Scientific	1111-2520	10 架
LBS 培养基
1 M Tris 缓冲液（pH ~7.5）			1 M 储存液 50 mL（62 mL HCl，938 mL 去离子水，121 g Trizma Base）
琼脂	Technical Fisher	DF0812-17-9	15 g（仅用于制备平板）
去离子水			950 mL
氯化钠	Fisher	S640-3	20 g
胰蛋白胨	Fisher	BP97265	10 g
酵母提取物	Fisher	BP9727-2	5 g