在透化神经元生长锥中用罗丹明标记F-肌动蛋白的钝端

摘要

本文介绍了一种用于可视化和定量神经元生长锥中F-肌动蛋白裸端的方法。将神经元在玻璃盖玻片上培养后，用含皂苷的溶液对细胞进行透化处理。随后，在含罗丹明标记肌动蛋白的皂苷缓冲液中短时间孵育，使荧光肌动蛋白结合到游离的肌动蛋白裸端上。

摘要

生长中轴突的运动末端称为生长锥。生长锥通过与局部表达的分子导向信号分子相互作用，引导轴突在发育组织中迁移；这些信号分子结合生长锥上的受体，并调控生长锥细胞骨架的动力学与结构组织^3-6。这些导航信号的主要作用靶点是充满生长锥周边区域的肌动蛋白丝网状结构，该结构通过持续的肌动蛋白聚合和动态重塑驱动生长锥的运动⁷。阳性或趋化性导向信号通过促进靠近趋化因子来源一侧的生长锥周边区域肌动蛋白丝（F-actin）的聚合，诱导生长锥转向。这种肌动蛋白聚合促使该区域生长锥局部突出、前缘黏附以及轴突向趋化因子方向延伸。

肌动蛋白丝的聚合依赖于充足的肌动蛋白单体供应，以及可用于单体添加的聚合化核心或肌动蛋白丝的钝端。在鸡胚视网膜和背根神经节（DRG）的生长锥中，肌动蛋白单体含量丰富。因此，当游离的F-肌动蛋白钝端可用于单体添加时，聚合过程会迅速增强。这一现象在鸡胚DRG和视网膜生长锥中通过局部激活F-肌动蛋白切割蛋白——肌动蛋白去聚合因子（ADF/cofilin）实现，该激活发生在生长锥靠近趋化吸引物的区域^8-10。增强的ADF/cofilin活性可切断肌动蛋白丝，从而产生新的F-肌动蛋白钝端以促进聚合。以下方法用于演示这一机制。通过荧光鬼笔环肽染色来可视化F-肌动蛋白的总量。通过向经特定方法透化的生长锥中引入罗丹明标记的肌动蛋白，可实现对F-肌动蛋白钝端的可视化，该透化方法改编自先前对其他运动细胞的研究^{11, 12}。当罗丹明-肌动蛋白的添加浓度高于其向钝端添加单体的临界浓度时，罗丹明-肌动蛋白将组装到游离的钝端上。若趋化吸引信号呈梯度分布，例如由位于生长锥一侧的微移液管释放，则罗丹明-肌动蛋白在朝向微移液管一侧的生长锥中的钝端结合量将更高¹⁰。

生长锥是微小而精细的细胞结构。透化、罗丹明标记的肌动蛋白掺入、固定以及荧光观察等步骤均需小心操作，可在倒置显微镜载物台上进行。这些方法可用于研究迁移神经元、其他原代组织细胞或细胞系中局部的肌动蛋白聚合过程。

方案

对于罗丹明-肌动蛋白标记，将神经元培养在置于35 mm塑料培养皿底部的玻璃盖玻片上，或培养在粘附于“录像”培养皿中的盖玻片上。

1. 盖玻片或“视频”培养皿的准备

1. 许多神经元类型对黏附性较差 体外 底物。本实验步骤需要使用盖玻片，若未充分清洁和处理，玻璃盖玻片可能无法提供足够的神经元-底物黏附力。有关盖玻片酸洗和清洁的详细步骤，参见Banker和Goslin主编的《神经细胞培养》一书。或者，也可采用硝酸纤维素包被盖玻片的方法，该涂层可高效结合底物分子，具体步骤见下文1.7和1.8。
2. 玻璃盖玻片（例如 18 mm 方形或 24 mm 圆形）用 dH₂O 冲洗₂O 并在干热条件下（≥225°C尽可能长时间地清洗（至少数天至三个月或更长时间），以去除有机化合物残留。然后进行步骤1.6；若使用视频培养皿，则进入步骤1.3。
3. 为制备适用于高分辨率视频显微镜的薄而透明的玻璃基底，使用电动打孔器（或类似工具）在35 mm或50 mm塑料培养皿或组织培养皿底部钻出适当直径的圆形孔。钻孔时应缓慢操作并施加轻压，以避免塑料开裂。随后用剪刀刮削钻孔边缘，使两侧表面均保持光滑。
4. 玻璃盖玻片按1.1或1.2节所述方法清洗，用于组织培养。将盖玻片用无毒硅胶水族箱胶粘剂固定在孔上（对于18×18 mm盖玻片，使用直径12 mm的钻头）。胶水固化24小时。
5. （以下步骤均在....

讨论

本文所介绍的方法能够实现对迁移生长锥前沿边缘动态重塑肌动蛋白细胞骨架过程中所涉及的细胞组分进行时间和空间上的精确解析。吸引分子（如NGF或netrin）可快速促进肌动蛋白丝的聚合，其作用表现为局部肌动蛋白尖端数量的增加，这一现象由活化的ADF/cofilin介导的肌动蛋白丝切割产生。¹⁰如图1和图2所示。该方法可用于定位参与介导生长锥趋化反应的其他蛋白质，例如图3和图4所示的ERM蛋白——radixin。这些方法也可用于分析神经元、胶质细胞或其他细胞类型在迁移过程中基于肌动蛋白的运动性的调控机制。

生长锥或其他小型运动结构的精细特性是该方法应用中的一个重要限制因素。生长锥的前沿边缘或细胞中类似的运动区域所含的结构成分很少，除了肌动蛋白丝和质膜之外几乎没有其他结构，因此每一步操作都必须格外小心。在更换溶液时，由于表面张力的变化，细胞聚集体或组织外植块可能会受到破坏。如实验方案中所述，最好将移液管置于盖玻片边缘进行溶液更换，而使用流动池则可消除由表面张力引起的问题。

一种可视化细胞运动区域中肌动蛋白钝端的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
18x18 mm 盖玻片	Gold Seal	3305
35 mm 培养皿	Falcon BD	351008
水族箱胶		DAP 100% 硅酮水族箱密封剂	任何五金商店
聚-D-赖氨酸（分子量 > 300,000）	Sigma-Aldrich	P1024
天然小鼠层粘连蛋白	Invitrogen	23017-015
L1 CAM	R&D Systems	777-NC
Alexa Fluor 350 鬼笔环肽	Invitrogen	A22281
罗丹明非肌动蛋白	Cytoskeleton, Inc.	APHR-A
F12 培养基	Invitrogen	21700-075
B27	Invitrogen	17504-044
Slowfade	Invitrogen	536937