本文介绍了一种用于可视化和定量神经元生长锥中F-肌动蛋白裸端的方法。将神经元在玻璃盖玻片上培养后，用含皂苷的溶液对细胞进行透化处理。随后，在含罗丹明标记肌动蛋白的皂苷缓冲液中短时间孵育，使荧光肌动蛋白结合到游离的肌动蛋白裸端上。
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摘要
摘要
生长中轴突的运动末端称为生长锥。生长锥通过与局部表达的分子导向信号分子相互作用，引导轴突在发育组织中迁移；这些信号分子结合生长锥上的受体，并调控生长锥细胞骨架的动力学与结构组织3-6。这些导航信号的主要作用靶点是充满生长锥周边区域的肌动蛋白丝网状结构，该结构通过持续的肌动蛋白聚合和动态重塑驱动生长锥的运动7。阳性或趋化性导向信号通过促进靠近趋化因子来源一侧的生长锥周边区域肌动蛋白丝（F-actin）的聚合，诱导生长锥转向。这种肌动蛋白聚合促使该区域生长锥局部突出、前缘黏附以及轴突向趋化因子方向延伸。
肌动蛋白丝的聚合依赖于充足的肌动蛋白单体供应，以及可用于单体添加的聚合化核心或肌动蛋白丝的钝端。在鸡胚视网膜和背根神经节（DRG）的生长锥中，肌动蛋白单体含量丰富。因此，当游离的F-肌动蛋白钝端可用于单体添加时，聚合过程会迅速增强。这一现象在鸡胚DRG和视网膜生长锥中通过局部激活F-肌动蛋白切割蛋白——肌动蛋白去聚合因子（ADF/cofilin）实现，该激活发生在生长锥靠近趋化吸引物的区域8-10。增强的ADF/cofilin活性可切断肌动蛋白丝，从而产生新的F-肌动蛋白钝端以促进聚合。以下方法用于演示这一机制。通过荧光鬼笔环肽染色来可视化F-肌动蛋白的总量。通过向经特定方法透化的生长锥中引入罗丹明标记的肌动蛋白，可实现对F-肌动蛋白钝端的可视化，该透化方法改编自先前对其他运动细胞的研究11, 12。当罗丹明-肌动蛋白的添加浓度高于其向钝端添加单体的临界浓度时，罗丹明-肌动蛋白将组装到游离的钝端上。若趋化吸引信号呈梯度分布，例如由位于生长锥一侧的微移液管释放，则罗丹明-肌动蛋白在朝向微移液管一侧的生长锥中的钝端结合量将更高10。
生长锥是微小而精细的细胞结构。透化、罗丹明标记的肌动蛋白掺入、固定以及荧光观察等步骤均需小心操作，可在倒置显微镜载物台上进行。这些方法可用于研究迁移神经元、其他原代组织细胞或细胞系中局部的肌动蛋白聚合过程。
方案
对于罗丹明-肌动蛋白标记，将神经元培养在置于35 mm塑料培养皿底部的玻璃盖玻片上，或培养在粘附于“录像”培养皿中的盖玻片上。
1. 盖玻片或“视频”培养皿的准备
- 许多神经元类型对黏附性较差 体外 底物。本实验步骤需要使用盖玻片，若未充分清洁和处理，玻璃盖玻片可能无法提供足够的神经元-底物黏附力。有关盖玻片酸洗和清洁的详细步骤，参见Banker和Goslin主编的《神经细胞培养》一书。或者，也可采用硝酸纤维素包被盖玻片的方法，该涂层可高效结合底物分子，具体步骤见下文1.7和1.8。
- 玻璃盖玻片（例如 18 mm 方形或 24 mm 圆形）用 dH₂O 冲洗2O 并在干热条件下（≥225°C尽可能长时间地清洗（至少数天至三个月或更长时间），以去除有机化合物残留。然后进行步骤1.6；若使用视频培养皿，则进入步骤1.3。
- 为制备适用于高分辨率视频显微镜的薄而透明的玻璃基底，使用电动打孔器（或类似工具）在35 mm或50 mm塑料培养皿或组织培养皿底部钻出适当直径的圆形孔。钻孔时应缓慢操作并施加轻压，以避免塑料开裂。随后用剪刀刮削钻孔边缘，使两侧表面均保持光滑。
- 玻璃盖玻片按1.1或1.2节所述方法清洗，用于组织培养。将盖玻片用无毒硅胶水族箱胶粘剂固定在孔上（对于18×18 mm盖玻片，使用直径12 mm的钻头）。胶水固化24小时。
- （以下步骤均在无菌条件下进行）将视频培养皿用无菌去离子水冲洗3次2O 并使其自然干燥。
- 盖玻片涂覆有用于神经元培养的底物分子。首先，将盖玻片表面用（250 μL 用于18x18盖玻片的溶液 100 μg/ mL 多聚-D-赖氨酸在 PBS 中孵育 4–8 小时（或过夜）于湿润环境中 38° C 孵育箱。然后用无菌去离子水将盖玻片冲洗3次2O以去除未结合的多聚-D-赖氨酸，并使其自然晾干。若培养基中含有血清蛋白，则许多类型的神经元均可在仅涂覆多聚-D-赖氨酸的盖玻片上进行培养。然而，结果更贴近于 体内 通过使用天然底物分子获得这些条件。这些分子的溶液，如层粘连蛋白、纤连蛋白或L1 CAM（1-20 μg/ mL 的 PBS 溶液）可直接应用于聚-D-赖氨酸包被的盖玻片，孵育 4–8 小时或过夜；但在本实验室，我们通常先在制备好的盖玻片上涂覆一层硝酸纤维素薄膜，再施加细胞黏附分子，以增强蛋白质与基质的结合。
- 将5 g硝酸纤维素溶解于5 mL 100%乙酸戊酯中，配制成1%硝酸纤维素溶液。应用 10 μL 将该溶液滴加到盖玻片上，并轻轻铺展至整个表面。室温下静置干燥10分钟。
- 应用 250 μL 溶液的 25 μg/ mL 层粘连蛋白或 4 μg/ mL L1 CAM 溶于 PBS 中，铺展于硝酸纤维素膜表面，在湿润环境中孵育 4 小时（或过夜） 38° C 孵育器中，吸除培养基质后立即加入培养液，以防止基质干燥。
2. 神经元培养物的制备
- 将孵化7天的鸡胚从鸡蛋中取出，置于含有10%血清培养基的100 mm培养皿中，在体视显微镜下进行解剖，去除胸腔和腹腔内的内脏器官。
- 随后用培养基冲洗胚胎，并转移至含液体培养基的60 mm培养皿中，进一步解剖以分离并制备背根神经节（DRG）或神经视网膜组织的外植体。详细的解剖步骤可参见Hollenbeck和Bamburg主编的《细胞生物学方法》第71卷《神经元：细胞生物学家的方法与应用》。DRG外植体为半完整神经节，神经视网膜外植体直径为1 mm或更小。
- 在清除外植体的多余组织后，用钟表匠镊子将单个外植体转移至已置于含培养基培养皿中的盖玻片上。在解剖显微镜下，用镊子轻轻将外植体压至盖玻片中央，以防止在转运至培养箱过程中发生移动。外植体在F12培养基中培养，添加B27成分，用10 mM HEPES缓冲至pH 7.4，并置于湿润环境中过夜 38° C 培养箱。根据需要可在培养基中添加生长因子。对于较晚期胚胎的背根神经节培养，常需添加神经营养因子，但E7背根神经节神经元在未添加神经营养因子的情况下亦能从外植体延伸出轴突。神经视网膜外植体在此培养基中无需添加生长因子即可延伸轴突。
- 培养物需孵育至少18小时，以确保在开始以下操作前有充分的轴突生长。
3. 罗丹明-肌动蛋白透化缓冲液的制备
- 含有138 mM KCl、10 mM PIPES、3 mM EGTA、4 mM MgCl的透化缓冲液储存液2，1% BSA（pH = 6.9）可在 4°C11. 使用前，加入以下成分，终浓度分别为：0.025% 皂苷、0.1 mM ATP 和 100 nM Alexa Fluor 350 鬼笔环肽。
- 另一种溶液也在使用前临时配制，成分除上述物质外，另加入 0.45μM 罗丹明非肌动蛋白 溶液交替进行涡旋振荡和吹打5分钟，以溶解罗丹明-肌动蛋白的团块；在初始透化步骤中涡旋振荡1分钟，以防止溶液在离心管中发生聚合。如果尽管采取上述操作，离心管中仍存在丝状结构组装的问题，可在使用前将溶液离心。
4. 神经元培养物的通透化及罗丹明标记的肌动蛋白结合到F-肌动蛋白的正端
- 从培养箱中小心取出含有背根神经节（DRG）或视网膜外植体的培养皿，并在室温下进行以下步骤。
- 所有溶液更换操作必须小心进行。移液枪头应置于盖玻片边缘，缓慢且轻柔地移除和添加溶液，避免施加过大力量。
- 用移液枪小心但稳定地吸除培养基，加入足量的透化缓冲液以覆盖细胞，作用1分钟（对于18 mm × 18 mm的盖玻片，约60 μL）。在加入透化缓冲液前，不得用其他溶液冲洗培养物，且在加入透化缓冲液前不得让盖玻片干燥。
- 轻轻吸除透化缓冲液，更换为含有0.45 μM罗丹明标记的非肌肉肌动蛋白的透化缓冲液，作用4分钟。
- 轻轻吸除含罗丹明-肌动蛋白的缓冲液，然后加入固定液（含4%多聚甲醛（实验室级，用磷酸盐缓冲液配制，pH 7.3）、0.05%戊二醛和10%蔗糖）对神经元进行固定。固定5分钟后，用PBS轻轻冲洗盖玻片，并将其封片于3英寸载玻片上的Slowfade封片剂中。
- 更换溶液的另一种方法是使用灌流小室。可采用市售的灌流小室，也可通过在盖玻片四角放置小块塑料（厚度≤1 mm）作为垫片，再将另一块相同大小的盖玻片覆盖其上来自制简易灌流小室。通过在一侧放置移液枪头，在另一侧使用吸水材料（如棉签或Kimwipe）引流，即可实现溶液的交换。
- 通过60倍油镜配合落射荧光光学系统观察罗丹明-肌动蛋白在F-肌动蛋白尖端的掺入以及荧光鬼笔环肽对生长锥中F-肌动蛋白的标记，并使用冷却CCD相机采集图像。共聚焦显微镜可提供更优的成像效果。
- 为准确量化罗丹明-肌动蛋白的掺入情况，所有图像应在同一次成像会话中采集，且每张图像均使用相同的数字相机增益和曝光参数设置。图像分析应基于各图像中的等效区域进行，可使用Metamorph、Image J或类似的计算机图像分析工具。
本实验方案的变体
5. 变体一：在罗丹明-肌动蛋白标记前采集活细胞图像
- 将培养皿置于预热的显微镜载物台上，采集生长锥的活细胞图像。可使用带网格的盖玻片，或在盖玻片上做刻痕和/或笔迹标记，以便在标记后更容易找到特定细胞；或者在整个实验过程中将培养皿固定在显微镜载物台上。
- 通透处理、罗丹明-肌动蛋白掺入以及细胞固定均在培养皿中进行，可在显微镜载物台上或取下后操作。固定完成后，向培养皿中加入 PBS，以便立即成像。若需保存样品以备后续成像，可在盖玻片上滴加 SlowFade 封片剂，然后轻轻盖上另一块相同大小的盖玻片（避免产生气泡），最后用透明指甲油密封边缘。
6. 变体二：免疫化学共标记其他蛋白质
- 如上所述（4.2-4.4），罗丹明-肌动蛋白的掺入和固定可在盖玻片或视频培养皿中培养的神经元上进行。
- 固定后，用 PBS 洗涤细胞，随后用 PBS 中含 0.1 M 甘氨酸的溶液处理 15 分钟，然后用含 2% 山羊血清、1% BSA 和 0.1% Triton X-100（TX-100）的 PBS 溶液透化 1 小时。将盖玻片在含 1% BSA 的 PBS 中稀释的一抗溶液中孵育 1 小时。随后洗涤盖玻片，并在含 2% 山羊血清、1% BSA 和 0.1% TX-100 的 PBS 溶液中孵育 1 小时，再加入荧光标记的二抗（按 1:1000 比例稀释于含 1% BSA 的 PBS 中）孵育 1 小时。洗涤后，盖玻片再次在含 2% 山羊血清、1% BSA 和 0.1% TX-100 的 PBS 溶液中孵育 30 分钟，洗涤后封片于抗荧光淬灭封片剂中。某些蛋白质的定位会在初始透化步骤（4.3）中被破坏。为保留这些蛋白质以便通过抗体进行定位，可在透化缓冲液中加入 0.05% 多聚甲醛和 0.05% 戊二醛处理 1 分钟（即在加入罗丹明-肌动蛋白之前），此操作不会影响罗丹明-肌动蛋白对纤维末端的标记效果。
- 通过荧光显微镜或共聚焦显微镜采集三重标记的生长锥图像。
7. 变体三：评估导向线索对F-肌动蛋白游离正端的影响
- 在培养皿中加入浓度为几 ng/mL 的生长因子或导向信号分子，在孵育箱中处理数分钟（或适当的时间），然后将培养皿从孵育箱中取出并开始透化操作。此步骤可用于评估生长因子或导向信号分子对 F-肌动蛋白游离正端的短期作用。
- 可将含有神经元培养物的培养皿置于预热的显微镜载物台上，在开始透化及罗丹明-肌动蛋白掺入前，通过微移液管在生长锥附近释放形成浓度梯度的生长因子或导向信号分子。例如，对背根神经节神经元可释放神经生长因子（NGF），对视网膜神经节细胞可释放netrin。微移液管可在透化操作开始前仅引入1-2分钟。该方法可用于评估导向信号分子梯度对生长锥前缘F-肌动蛋白游离正端形成的局部效应（参见参考文献10中的图像）。
- 这些变异方法可与上述6.2中所述的抗体标记其他神经元组分的方法联合使用。
8. 变体四：转染神经元中无F-肌动蛋白的裸露末端标记
- 可以使用组成型活性或显性负性构建体，或利用RNAi（带有荧光标识标记）进行蛋白敲低，以评估某蛋白在调控F-actin游离正端中的作用。根据目标蛋白的性质、其在生长锥内的定位情况以及是否融合了荧光标签，转染细胞中表达的荧光蛋白可能在透化过程中丢失。若存在此情况，可先在透化前使用视频培养皿在显微镜下识别转染细胞，并在标记转染细胞位置后，直接在显微镜载物台上进行透化操作。或者，可将GFP-actin构建体与感兴趣的GFP-构建体共转染。在此情况下，GFP-actin会被整合入F-actin中，不会因透化而丢失，从而可在透化后识别出转染细胞。
- 该变式可与上述7.1–7.3中所述的导向线索添加相结合使用。
9. 代表性结果
图1. 全局添加神经生长因子（NGF）可增加生长锥前缘的总F-肌动蛋白及F-肌动蛋白裸端数量。 当背根神经节（DRG）生长锥经神经生长因子（NGF）刺激5分钟后，其前缘的肌动蛋白聚合被激活，在生长锥周边可见一条明亮的罗丹明-肌动蛋白标记带。图1比较了未受刺激与经NGF刺激的DRG生长锥中罗丹明-肌动蛋白的掺入情况。合并图像中的绿色荧光为生长锥中F-肌动蛋白的鬼笔环肽标记，红色荧光为罗丹明-肌动蛋白标记。裸端标记的一个良好对照是在步骤4.2和4.3中于透化缓冲液中加入10⁻⁶ M或更高浓度的细胞松弛素B或D。细胞松弛素可封闭F-肌动蛋白的裸端，抑制罗丹明-肌动蛋白与裸端的结合，从而显著减少或完全消除罗丹明-肌动蛋白在细胞内的掺入。比例尺：10 μm。
图 2. NGF 梯度局部增加 F-肌动蛋白的裸露末端。 将释放 NGF 的微吸管置于背根神经节生长锥的一侧，持续 2 分钟，随后对 F-肌动蛋白的游离裸露末端进行标记。下方图像显示，在靠近微吸管的生长锥区域，NGF 梯度刺激了 F-肌动蛋白游离裸露末端的局部增加。合并图像中，鬼笔环肽显示为绿色，罗丹明-肌动蛋白显示为红色。比例尺：10 μm。
图3. 活化的ERM蛋白在生长锥前缘富集。 对磷酸化Ezrin/Radixin/Moesin（pERM）与F-肌动蛋白游离正端进行免疫细胞化学标记。在初始透化缓冲液中加入戊二醛（0.05%）和多聚甲醛（0.05%）处理1分钟，以保持ERM蛋白的定位。罗丹明标记的肌动蛋白为红色；pERM为绿色；鬼笔环肽为蓝色。比例尺，10 μm。
图4. 肌动蛋白聚合的刺激需要活性ERM蛋白。 分离的背根神经节（DRG）细胞共转染GFP-肌动蛋白和GFP对照质粒，或显性负性Ezrin/Radixin/Moesin（DN ERM）构建体。使用GFP-肌动蛋白可在透化后识别转染的细胞。在此，神经生长因子（NGF）在标记F-肌动蛋白尖端前5分钟加入。请注意，转染了DN ERM的生长锥其前端边缘的尖端水平降低（下中图），与邻近未转染的生长锥（下图）或GFP对照（上中图）形成对比。罗丹明-肌动蛋白，红色；GFP-肌动蛋白，绿色。比例尺，10 μm。
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讨论
本文所介绍的方法能够实现对迁移生长锥前沿边缘动态重塑肌动蛋白细胞骨架过程中所涉及的细胞组分进行时间和空间上的精确解析。吸引分子（如NGF或netrin）可快速促进肌动蛋白丝的聚合，其作用表现为局部肌动蛋白尖端数量的增加，这一现象由活化的ADF/cofilin介导的肌动蛋白丝切割产生。10如图1和图2所示。该方法可用于定位参与介导生长锥趋化反应的其他蛋白质，例如图3和图4所示的ERM蛋白——radixin。这些方法也可用于分析神经元、胶质细胞或其他细胞类型在迁移过程中基于肌动蛋白的运动性的调控机制。
生长锥或其他小型运动结构的精细特性是该方法应用中的一个重要限制因素。生长锥的前沿边缘或细胞中类似的运动区域所含的结构成分很少，除了肌动蛋白丝和质膜之外几乎没有其他结构，因此每一步操作都必须格外小心。在更换溶液时，由于表面张力的变化，细胞聚集体或组织外植块可能会受到破坏。如实验方案中所述，最好将移液管置于盖玻片边缘进行溶液更换，而使用流动池则可消除由表面张力引起的问题。
一种可视化细胞运动区域中肌动蛋白钝端的...
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致谢
作者感谢 James Bamburg 博士及其实验室成员在本研究中的合作。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 HD19950、EY07133，以及明尼苏达医学基金会的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 18x18 mm 盖玻片 | Gold Seal | 3305 | |
| 35 mm 培养皿 | Falcon BD | 351008 | |
| 水族箱胶 | DAP 100% 硅酮水族箱密封剂 | 任何五金商店 | |
| 聚-D-赖氨酸（分子量 > 300,000） | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| 天然小鼠层粘连蛋白 | Invitrogen | 23017-015 | |
| L1 CAM | R&D Systems | 777-NC | |
| Alexa Fluor 350 鬼笔环肽 | Invitrogen | A22281 | |
| 罗丹明非肌动蛋白 | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | |
| F12 培养基 | Invitrogen | 21700-075 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
参考文献
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