评估抗生素诱导的丝状化现象 大肠杆菌 使用平板测定法和流式细胞术

摘要

来源：Cayron, J., and Lesterlin, C. 应激处理条件下细菌生长的多尺度分析。 J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了在使用抑制细胞分裂的抗生素处理条件下，通过平板计数法测定活力以及流式细胞术分析细胞大小和DNA含量，来评估大肠杆菌（E. coli）丝状化及DNA复制的实验流程。

方案

1. 铺板实验

注意：平板测定法用于测量培养样品中能够形成菌落形成单位（CFU）的细胞浓度。该实验方法可揭示单个细胞分裂为两个活细胞的速率，并可用于检测细胞分裂阻滞（例如细菌世代时间延长或细胞裂解增加）。

1. 将200 µL培养样品在新鲜培养基中进行10倍系列稀释，直至10^-7。取适当稀释度的样品100 µL，接种于非选择性的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，37 °C过夜培养后获得3−300个菌落。注意：系列稀释必须在新鲜培养基中快速完成，以限制细菌分裂。或者，研究人员可考虑使用不含碳源的生理盐水溶液，以防止稀释过程中细胞分裂。
2. 次日，计数菌落数量，以确定各培养样品中活细胞的浓度（CFU/mL）。绘制未经处理和经处理的细胞培养物的CFU/mL随时间变化曲线。

2. 流式细胞术

注意： 以下部分描述了用于流式细胞术分析的细胞样品制备。该分析技术可揭示大量细胞的细胞大小和DNA含量分布情况。应尽可能立即处理流式细胞术样品。若无法立即处理，可将样品置于冰上保存（不超过6小时），并在当天完成铺板和显微镜成像后，统一进行分析。

1. 将250 µL培养样品稀释，用4 °C的新鲜培养基定容至250 µL，使细胞浓度约为15,000 个细胞/µL（对应OD_600nm ~0.06）。
   注意：冰上孵育可限制细胞生长和形态变化。或者，用户也可考虑用75%乙醇固定细胞，这通常是流式细胞术推荐的处理方式。
2. 进行DNA染色时，将细菌样品与10 µg/mL的DNA荧光染料溶液按1:1比例混合，避光孵育15分钟，然后进行样品分析。
3. 将样品以约120,000 个细胞/分钟的流速上机进行流式细胞仪检测。在适当设置下，采集前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC）以及DNA荧光染料的荧光信号（FL-1）。
4. 绘制FSC与FL-1的细胞密度直方图，以表示细胞群体中细胞大小和DNA含量的分布情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	BioRad	1613100	认证分子生物学级琼脂糖
Attune NxT 声学聚焦流式细胞仪	ThermoFisher Scientific	A24858	流式细胞仪
E. coli 菌株，携带染色体插入的 hupA-mCherry 融合基因			通过 P1 转导将 hupA-mCherry 导入 E. coli MG1655 菌株构建而成
LB 琼脂糖培养基	MP Biomedicals	3002232	用于涂布实验的生长培养基
SYTO9 绿色荧光核酸染料	ThermoFisher Scientific	S34854	DNA 荧光染料