利用微生物微滴培养系统进行细菌的适应性进化

摘要

来源： Jian, X., et al., 利用微生物微滴培养系统（MMC）实现微生物自动化培养与适应性进化。J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了利用微生物微滴培养系统驱动细菌向耐受甲醇方向进行适应性进化的实验方法。通过将基因工程改造的细菌培养物与高浓度甲醇胁迫培养基混合并分割成微滴，该系统可筛选出在甲醇胁迫条件下生长能力增强的突变菌株。经过多轮迭代富集循环及单菌落分离，获得适应甲醇环境的细菌菌株，用于后续分析或应用。

方案

MMC 中的适应性进化

1. 初始细菌溶液的制备
   1. 按照相关标准规程配制 MeSV2.2 所需的特殊液体培养基和固体平板，并在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。
   2. 在37 °C恒温培养箱中，使用固体培养板（直径 = 90 mm）培养MeSV2.2，持续72 h。随后挑取单菌落，接种于含10 mL专用液体培养基的50 mL摇瓶中，在37 °C、200 rpm条件下于摇床培养箱中培养72 h。
   3. 将培养的 MeSV2.2 溶液用培养基稀释至 OD₆₀₀ 0.1–0.2（确保总体积不少于10 mL），并在摇瓶中继续培养5小时，以获得初始菌液。
      注意： MeSV2.2 是一种甲醇依赖型菌株 E. coli 菌株。这种特殊液体培养基含有 500 mmol/L 甲醇，对 MeSV2.2 具有强烈胁迫作用，导致其生长极为缓慢。
2. 初始化显微镜控制中心（MMC）。
3. 取出两个已灭菌的试剂瓶，其中一个用于盛装初始菌液，另一个用于盛装新鲜培养基。将初始菌液（5 mL）、新鲜培养基（12–15 mL）和MMC油加入试剂瓶中。
   注意： 由于适应性进化是一个涉及多次继代培养的长期过程，应在MMC中尽可能多地储存新鲜培养基。实验过程中无法补充培养基。
4. 将两个试剂瓶安装到MMC中。将用于初始细菌溶液的试剂瓶安装在C2和O2连接器之间，将用于新鲜培养基的试剂瓶安装在C4和O4连接器之间。
5. 单击 ALE 以选择自适应进化功能 （图1B）。 在参数设置界面中，打开 OD 检测开关。

6. 将数量设为50，波长设为600 nm，浓度设为0%，类型设为时间，参数设为30 h，重复次数设为99。点击“开始”以启动液滴生成，过程约需25分钟。
   注意： 此处，“浓度”指适应性进化中化学因子的最大浓度。对于不同的液滴，可在微流控芯片（MMC）中引入不同浓度的化学因子，以提供不同的生长条件。使用以下公式计算引入的浓度：

   

   此处，“C" 指引入液滴中的化学因子的浓度；a指C4和O4连接器之间试剂瓶中化学因子的浓度；b指C6和O6连接器之间试剂瓶中化学因子的浓度；以及"i“浓度”指可选的浓度梯度。MMC 中提供八种不同浓度。此处的化学因子为单一浓度（500 mmol/L 甲醇），且为培养基的组分之一，因此仅安装一个含有该化学因子的试剂瓶，并将浓度设置为 0%。类型指传代培养模式，分为三种：时间模式、OD 值模式和荧光强度模式。前者指液滴培养固定时间后进行传代，后两者指液滴培养至预设的 OD 值或荧光强度后进行传代。参数指选择传代培养模式时所需的相应参数。重复次数指传代培养的次数。

7. 移除位于C2和O2接头之间的试剂瓶。
8. 观察每个传代培养期间液滴的最大OD值是否显著增加。若增幅达到实验要求，点击数据导出按钮以导出OD数据。
   注意：此处的继代培养周期取决于参数设置。例如，当类型设为时间、参数设为30 h时，继代培养周期即为30 h。在每个继代培养周期内，液滴会出现最大OD值。通过最大OD值的增长情况来判断适应性进化是否达到实验要求（增长幅度取决于菌株的实际培养过程，例如增长超过20%）。注意观察储存的新鲜培养基是否耗尽。若培养基已耗尽但仍未出现显著增长，则应挑取生长较好的液滴，进行新一轮的适应性进化。
9. 从MMC中提取目标液滴。
   1. 单击筛选按钮以选择液滴提取功能 （图1C）选择“收集”选项，点击目标液滴数量，然后点击“确定”。
      注意： 液滴筛选包括“收集”、“弃去”和“提取种子溶液”。“提取种子溶液”是指在继代培养操作后收集剩余的液滴。
   2. 等待弹出窗口提示“请拔出 CF 快速连接头并将其放入 EP 管中”。根据软件提示，将 CF 快速连接头放入微量离心管中收集，然后点击确定 （图2D）).
   3. 1～2 分钟后，软件界面将弹出一个新窗口，提示“请重新插入连接器，然后单击确定”。随后，将 CF 快速连接器重新插入，并单击“确定”，使 MMC 继续运行 （图2D）.
      注意： 在收集完所有目标液滴后，MMC 将继续培养剩余的液滴。若无需继续培养，可点击“停止”以直接终止操作。
   4. 使用2.5 µL移液器吸取液滴，滴加至90 mm琼脂糖平板上，用边长为3 cm的三角形玻璃涂布棒均匀涂布。随后置于37 °C恒温培养箱中培养72 h。
   5. 挑取3-5个独立菌落，分别接种于装有10 mL新鲜培养基的50 mL摇瓶中，在37 °C、200 rpm条件下于摇床培养箱中培养48-72 h。按照相关标准操作规程，将培养好的菌液分装至甘油管中保存，用于后续实验。

结果

图1：MMC 操作软件界面。（A）软件主界面。（1）操作腔室内的温度。（2）液滴识别的光电信号值。当液滴通过时，信号值较高（>2 V）；当油相通过时，信号值较低（<1 V）。（3）功能选择。共有四种功能可供选择：生长曲线测量（Growth Curve）、适应性实验...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
甲醇	MACKLIN	M813895	MeSV2.2专用培养基的组分
微生物微滴培养系统（MMC）	洛阳泰茂树生物科技有限公司	MMC-I	用于生长曲线测定和适应性进化实验。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
微流控芯片	洛阳泰茂树生物科技有限公司	MMC-ALE-OD	用于各种微滴操作。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/
MMC油相	洛阳泰茂树生物科技有限公司	MMC-M/S-OD	微滴微流控中的油相。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/
培养皿	康宁公司	90 mm	用于固体培养基的制备
移液器	eppendorf	2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	用于液体操作
快速连接头A	洛阳泰茂树生物科技有限公司	—	用于各接口之间的连接。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/
试剂瓶	洛阳泰茂树生物科技有限公司	MMC-PCB	用于菌液和试剂的取样与储存。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/
摇瓶	联合生物技术公司	50 mL	用于微生物培养
摇床培养箱	上海苏坤实业有限公司	SKY-210 2B	用于摇瓶中的微生物培养
硫酸链霉素	Solarbio	S8290	MeSV2.2专用培养基的组分
注射器	江苏知雨医疗器械有限公司	10 mL	用于吸取液体并注入试剂瓶中
注射器针头	欧贝尔五金店	22G	内径为0.41 mm，外径为0.71 mm