使用微生物微滴培养系统的细菌适应性进化

摘要

资料来源：Jian， X.等人，使用微生物微滴培养系统（MMC）进行自动化微生物培养和适应性进化。J. Vis. Exp.（2022）。

该视频演示了使用微生物微滴培养系统来驱动细菌向甲醇耐受性的适应性进化。通过将工程细菌培养物与高甲醇应激培养基混合并将它们分割成微液滴，该系统可以选择在甲醇胁迫下表现出良好生长的突变体。通过迭代富集循环和菌落分离，培养适应甲醇的细菌菌株以供进一步分析或应用。

方案

MMC 中的适应性进化

1. 初始细菌溶液的制备
   1. 按照相关标准规定制备MeSV2.2专用液体介质和固体板，在121°C高压灭菌15分钟。
   2. 使用实心板（直径= 90mm）在37°C恒温培养箱中培养MeSV2.27小时。然后，挑选一个独立的菌落，并将其与10mL特殊液体培养基一起在37°C的摇动培养箱（200rpm）中培养72小时。
   3. 用培养基稀释培养的MeSV2.2溶液至OD₆₀₀ 为0.1-0.2（确保总体积不小于10mL），并在摇瓶中继续培养5小时，以获得初始细菌溶液。
      注意： MeSV2.2 是一种甲醇必需大 肠杆菌 菌株。专用液体培养基含有500 mmol/L的甲醇，对MeSV2.2具有很强的压力，导致生长非常缓慢。
2. 初始化 MMC。
3. 取出两个灭菌试剂瓶，一个用于初始细菌溶液，另一个用于新鲜培养基。将初始细菌溶液（5 mL）、新鲜培养基（12-15 mL）和MMC油注入试剂瓶中。
   注意： 由于适应性进化是一个涉及多个亚培养的长期过程，因此在MMC中储存尽可能多的新鲜培养基。实验期间无法补充培养基。
4. 将两个试剂瓶安装到 MMC 中。将一个用于 C2 和 O2 连接器之间的初始细菌溶液安装，另一个用于 C4 和 O4 连接器之间的新鲜介质。
5. 单击 ALE 以选择适应性进化的功能 （图 1B）。 在参数设置界面，打开OD检测开关。

6. 将“数字”设置为 50，“波长”设置为 600 nm，将“浓度”设置为 0%，将“类型”设置为“时间”，将“参数”设置为 30 小时，将“重复次数”设置为 99。单击“开始”开始生成液滴。大约需要 25 分钟。
   注意： 这里，“浓度”是指适应性进化的化学因子的最大浓度。对于不同的液滴，在MMC中可以实现引入不同浓度的化学因子，提供不同的生长条件。使用以下公式计算引入的浓度：

   

   这里，“C” 是指引入液滴中的化学因子的浓度;“a”是指C4和O4连接器之间试剂瓶中化学因子的浓度;“b”是指C6和O6连接器之间试剂瓶中化学因子的浓度;“i”是指可用浓度。MMC 中有八种浓度可供选择。由于这里的化学因子具有单一浓度（500 mmol/L甲醇），并且是培养基的成分之一，因此这里只安装一个含有化学因子的试剂瓶，浓度设置为0%。类型是指亚培养的模式，分为时间模式、OD值模式、荧光模式三种。前者是指将液滴培养固定时间，然后进行传代培养，而后两者是指将液滴培养到预定义的OD值/荧光强度，然后进行传代培养。参数是指选择亚栽培模式时所需的相关参数。重复是指子修种的次数。

7. 取出放置在 C2 和 O2 连接器之间的试剂瓶。
8. 观察每个亚培养期液滴的最大OD值是否显著增加。如果发生增加并满足实验要求，请单击“数据导出”按钮导出OD数据。
   注意：在这里，亚培养期取决于参数。例如，将类型设置为时间，参数设置为 30 小时时，子培养周期为 30 小时。在每个亚培养期间，液滴的OD值最大。通过增加最大OD值来估计适应性进化是否满足实验要求（增加取决于菌株的实际栽培过程，例如增加20%以上）。注意：注意储存的新鲜培养基是否用完。如果介质用尽后仍未出现显著增加，则提取生长较好的液滴，进行新一轮的适应性进化。
9. 从 MMC 中提取目标液滴。
   1. 单击“筛选”按钮以选择液滴提取功能 （图1C）。选择“收集”选项，单击目标液滴的数量，然后单击“确定”。
      注意： 液滴筛选包括“收集”、“丢弃”和“提取种子溶液”。“提取种子溶液”是指收集亚培养作后剩余的液滴。
   2. 等待弹窗提示“请拉出CF快速接头，放入EP管”。根据软件提示将CF快速接头放入微量离心管中进行收集，然后单击确定 （图2D）。
   3. 1-2分钟后，软件界面会弹出一个新窗口，提示“请重新插入连接器，完成后单击确定”。然后，将 CF 快速连接器插回并单击“确定”以使 MMC 继续运行（图 2D）。
      注意： 收集完所有目标液滴后，MMC将继续培养剩余的液滴。如果不需要培养，点击停止直接终止作。
   4. 使用 2.5 μL 移液器提取液滴，将其滴在 90 mm 琼脂糖板上，并用边长为 3 cm 的三角形玻璃铺展棒均匀铺展。然后，将其在37°C恒温培养箱中培养72小时。
   5. 挑选 3-5 个独立菌落，并在 50 mL 摇瓶中分别将它们与 10 mL 新鲜培养基一起在 37°C 的摇动培养箱 （200 rpm） 中培养 48-72 小时。按照相关标准规定，将培养的细菌溶液储存在甘油管中，以备后续实验。

结果

图1： MMC的作软件界面。（A）软件的主界面。（1）手术室内温度。（2）液滴识别的光电信号值。当液滴通过时，信号值为高电平 （>2 V）。当油通过时，信号值较低 （<1 V）。（3）功能选择。有四种功能可供选择：生长曲线测量（Growth Curve）、自适应实验室进化（ALE）、单因素多层次分析（One-factor）和根据实验需求定制作（Customization）。（4）参数设置界面。选择一个函数后，在此处设置相应...

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