微流控芯片中细菌细胞的制备

摘要

来源： Sutlief, A. L., 等活细胞剪切应力分析 铜绿假单胞菌 使用自动化高通量微流控系统。 J. Vis. Exp. (2019).

本视频演示了用于细菌培养物剪切应力研究的微流控板的制备过程。在用培养基对通道进行预处理后，将细菌细胞引入实验通道并孵育以使其附着。随后去除残留的培养基和培养物，为后续的剪切应力实验做好准备。

方案

1. 培养基制备

1. 配制含0.25%葡萄糖的最低培养基（MM）。配制1 L含0.25%葡萄糖的MM培养基时，将200 mL无菌M9盐溶液、2 mL无菌1 M硫酸镁（MgSO₄）、100 µL无菌1 M氯化钙（CaCl₂）和12.5 mL无菌20%（w/v）葡萄糖加入水中（dH₂O），定容至最终体积1 L。
2. 使用无菌操作技术将所需培养基转移至无菌瓶中。根据所用通道数量准备相应体积的培养基。通常，每个通道需要200 µL用于灌注、300 µL用于接种，以及1300 µL用于24小时实验。
3. 将培养基瓶置于设定为实验温度的培养箱或水浴中。使用前应使培养基达到实验温度，以避免微通道中产生气泡。

2. 过夜培养及实验培养物的制备 铜绿假单胞菌 表达增强型绿色荧光蛋白的PA01菌株（PA01-EGFP）。

1. 取15 mL实验培养基加入无菌侧口烧瓶中，并接种自接种有PA01-EGFP的琼脂平板上的一至两个菌落。将培养物置于37 °C、180–220 rpm的摇床培养箱中培养12–16小时。
2. 测定过夜培养物的OD₆₀₀。当OD₆₀₀大于0.80时，用新鲜MM培养基将过夜培养物稀释至终OD值为0.8。将实验培养物置于37 °C的培养箱或水浴中，待后续用于接种微流控通道。接种前立即再次检测OD₆₀₀，以确保其未显著偏离目标OD₆₀₀值（本实验中为0.8）。

3. 设备启动

1. 根据用户指南设置系统工作站，设置方式类似于图1所示。为避免仪器与软件连接时出现错误，请按以下顺序开启设备：
   PC工作站
   荧光模块。确保荧光快门处于开启状态（快门按钮旁的蓝灯亮起）
   硬件控制器
   成像系统控制器（见材料表）
   CCD相机
   成像工作站（显微镜）
   注意：应将加热板的温度调节至实验所需的温度。
2. 启动控制应用程序，并输入位于板侧面标签上的板编号。
   注意：控制应用程序启动后，将出现两个独立的应用程序窗口，一个用于控制显微镜/成像软件的软件，另一个用于控制泵和孔板接口的控制模块。

4. 微流控板的引物处理与细胞接种

注意：引物、接种、细菌附着及生长过程如图2所示。

1. 从包装中取出48孔微流控板，注意不要触碰板底部的玻璃表面。使用镜头纸、无绒布或低绒擦拭布清洁板底部小孔内的玻璃片。
2. 为润洗微流控通道，用移液器将200 µL 37 °C的MM培养基加入输出孔中，注意避免产生气泡。将板放入板架中，用乙醇擦拭接口，待其干燥后将其密封固定在板架上。
3. 在控制模块的手动模式下，将流体设置为
   37 °C的luria-bertani (LB)培养基，最大剪切力设为5.00 dyne/cm²。点击输出孔以启动从输出孔到输入孔的流体流动，从而润洗通道。润洗5分钟后，暂停流动以准备接种。小心地将板从板架上取下，并用移液器吸除输出孔中的残余培养基，但不要移除通向微流控通道的内圈中的任何培养基。
4. 为接种实验通道，首先向输入孔中加入300 µL MM培养基，然后向输出孔中加入300 µL细菌培养物。将板重新放回板架中，放置前务必擦拭接口。
5. 在控制模块上，将板架放置到显微镜载物台上后，通过实时摄像画面聚焦单个通道。在通过实时画面进行视觉监测的同时，以1.00–2.00 dyne/cm²恢复流动约2–4秒，使细胞进入实验通道，但不进入蛇形通道。将板留在温控载物台上孵育1小时，以使细胞贴附。在1小时孵育期间，可设置控制模块和Montage软件以进行自动运行。
   注意：接种所需时间会因培养基和生物体而异，因此应通过实时画面密切监测，直至优化并确定一般时间范围。板上不同区域的接种可能不均，某些通道列可能需要更长的流体作用时间以实现完全接种。
6. 贴附阶段结束后，轻柔地将板从载物台上取下，首先用移液器从输出孔中移除细菌，避免扰动通道。使用新的移液器吸头清除输入孔中的培养基。

结果

图1：微流控系统的各个组件。从左到右依次列出各个组件：1. CCD相机，2. 带有自动载物台、自动荧光模块和自动对焦模块的高分辨率倒置显微镜，3. 板载载物台，4. 成像系统接口，5. 手动显微镜载物台控制装置，6. 蒸汽捕集器，7. 成像系统控制器（含温度控制器），8. 硬件控制器，9. 荧光控制器，10. 不间断电源，11. 用于图...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化铵，ACS级	VWR	BDH9208-500G	最低培养基成分的一部分
BioFlux 1000 48孔低剪切力微孔板	Fluxion Biosciences	910-0047
BioFlux 1000Z 微流控成像系统	Fluxion Biosciences	BF 1000Z
二水合氯化钙，ACD级	VWR	97061-904	最小培养基成分的一部分
无水葡萄糖，ACS级	VWR	BDH9230-500G	最小培养基成分的一部分
硫酸镁 ACS 级	VWR	EM-MX0070-1	最小培养基成分的一部分
磷酸二氢钾，ACS 级	VWR	BDH9268-500G	最低培养基成分的一部分
铜绿假单胞菌 GFP	ATCC	15692GFP	铜绿假单胞菌 用于本研究的经GFP修饰的细菌菌株PA01。
氯化钠，ACS级	VWR	BDH9286-500G	最小培养基成分的一部分
磷酸二氢钠，无水，试剂级	VWR	97061-942	最低培养基成分的一部分