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方法文章

用于重建肿瘤微环境的微流控装置 体外

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DOI：

10.3791/2425

⸱

2011年11月20日

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University Of Massachusetts Amherst

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍了用于构建和运行一种可重现异质性肿瘤微环境的微流控装置的实验流程 体外采用荧光染色法对肿瘤组织内细胞凋亡的变异性进行定量分析，并评估化疗药物阿霉素在肿瘤组织中的有效扩散系数。

摘要

我们开发了一种微流控装置，可模拟药物向体外三维异质性肿瘤组织的递送及其系统性清除过程。由脉管系统输送的营养物质无法到达肿瘤的所有区域，从而形成了包含存活细胞、静止细胞和坏死细胞等多种细胞类型的异质性微环境。由于这种异质性，许多抗癌药物难以有效渗透并治疗所有类型的细胞。癌细胞的单层培养模型无法模拟这种异质性，使得在合适的体外模型中测试抗癌药物变得困难。我们的微流控装置采用软光刻技术以PDMS材料加工而成。通过悬滴法形成的多细胞肿瘤球体被插入装置上的矩形腔室中，并在一侧通过持续灌注培养基加以维持。装置上腔室的矩形结构在组织内建立了线性梯度。利用荧光染料对组织内凋亡的异质性进行定量分析。装置上的肿瘤模型用荧光化疗药物阿霉素（doxorubicin）处理，并通过延时显微镜监测药物在组织中的扩散过程，进而估算其有效扩散系数。悬滴法可快速从多种癌细胞系形成均一的球体。该装置支持球体生长达3天之久。靠近流动培养基的细胞凋亡程度较低，而远离通道的细胞则表现出更高的凋亡水平，从而准确模拟了肿瘤中邻近血管区域的微环境特征。所估算的阿霉素扩散系数与既往报道的人类乳腺癌中的数值一致。鉴于药物在实体瘤中的渗透与滞留情况直接影响其疗效，我们认为该装置是研究药物行为及开发新型抗癌疗法的重要工具。

方案

1. 器件制备

弹性体材料中微流控结构的复制基于Duffy等人1所描述的方法。

  1. 按9:1的质量比混合硅弹性体试剂盒（Dow Corning，Midland, MI）中的弹性体（聚二甲基硅氧烷；PDMS）和固化剂，浇注于母模上形成4 mm厚的层。脱气以去除气泡，并在60°C下固化5小时。将固化的PDMS从模具上剥离，得到具有流道结构的弹性体印章。
  2. 使用安装在台钻上的1.5 mm活检打孔器（Miltex，York, PA）在进样口和出样口位置打孔。清除残留碎屑。
  3. 将印章的结构面和洁净的玻璃载片置于氧气等离子体刻蚀仪中进行8分钟的氧气等离子体处理。立即使处理后的表面相互接触，以形成键合。将组装件置于载片加热器上，在60°C下保持至少5小时，以增强键合强度。
  4. 使用连接在带凸齿的雌性鲁尔锁接头（Qosina，Edgewood, NY）上的雄性鲁尔锁接头，将内径为0.032"的PTFE管（Cole Parmer，Vernon Hills, IL）连接至进样口和出样口。
  5. 使用关闭阀和Y型连接器（Upchurch Scientific，Oak Harbor, WA；图1）搭建流动装置。将装置固定在显微镜上。使用20G 1.5"针头（BD Bioscience，Rockville, MD）将注射器连接至管路。

2. 均一球形体的形成

类球体通过悬滴法形成2,3。

  1. 在无菌细胞培养罩内对细胞进行胰蛋白酶消化处理。
  2. 将胰蛋白酶消化后的细胞以 2000 rpm 离心 5 分钟，并重悬于 6 ml 新鲜培养基中。将储备液稀释至所需终浓度（见表 1）。
  3. 取下 48 孔板的盖子，将其倒置并放置于已灭菌的罩内。盖子上每个孔对应的圆形区域清晰可见。向 48 孔板的每孔中加入 1 ml 无菌水以维持湿度。使用微量移液器将 20 μl 稀释后的细胞悬液滴加至每个圆形区域。小心地将盖子翻转并盖回 48 孔板上，确保液滴不接触孔的边缘。
  4. 将 48 孔板置于 37°C 培养一定天数（见表 1）。每个悬滴中将形成一个球状体。

3. 将球状体引入装置

本节请参考图1和表2。

  1. 通过向流入端注入70%乙醇冲洗装置，对装置进行灭菌。随后用PBS冲洗，再用HEPES缓冲的细胞培养基冲洗。将培养基注射器SF保留在管路上。
  2. 用注射器SP吸取2-3个类球体，轻敲注射器以去除气泡，然后将其连接至装置的装填入口。
  3. 打开入口阀VPin，关闭VFin；打开出口阀VPout，关闭VFout。将装填注射器垂直放置，针头朝下；观察类球体沉降至注射器底部并进入针头的鲁尔锁接头处。推动装填注射器的推杆，观察类球体进入管路并流入装置。由于仅装填出口阀处于打开状态，类球体将进入装置腔室，并被后端的支柱截留（图2）。
  4. 关闭入口阀VPin和出口阀VPout。将注射器SF安装在注射泵上。打开阀VFin和阀VFout，以3 μl/min的流速将培养基注入装置。

4. 凋亡检测试剂（CaspGLOW）的引入

将类球体装入小室后，孵育最多24小时以建立营养梯度和微环境，然后再引入凋亡检测试剂或治疗药物。由于小室中的组织在顶部和底部均与不可渗透的壁接触，因此在组织厚度（0.15 mm）方向上不存在营养梯度。孵育24小时后，沿组织厚度方向的所有细胞层均具有等效性，唯一的异质性存在于远离流动通道的方向上。

  1. 关闭 VFin，停止注射泵，将注射器 SF 从泵上取下，并更换为装有含 0.25 μl/ml CaspGLOW Red Active Caspase-3 标记物（Red-DEVD-FMK；Biovision，Mountain View, CA）培养基的注射器。
  2. 手动将 0.7 ml 该溶液推注通过装置，以确保完全置换旧培养基。将注射器重新安装至泵上，恢复流体流动，并打开 VFin。在 5–8 小时内，凋亡检测试剂会扩散至组织中，并在发生凋亡的区域发出更强的荧光。此后所有流入装置的溶液均需维持该浓度的凋亡检测试剂。

注意：

  1. 可通过获取第 6 节所述的荧光线性强度分布来确认组织异质性。该分布应显示出细胞凋亡的空间梯度，从而证实组织在细胞活力方面具有异质性。
  2. 也可使用 CaspGLOW Green 活化型 Caspase-3 标记物（Fluorescein-DEVD-FMK；Biovision）检测细胞凋亡。该标记物含有绿色荧光素 fluorescein，而非红色荧光素罗丹明（rhodamine）。

5. 治疗剂的引入

  1. 按照步骤 4.1–4.2 的操作流程，引入含有凋亡检测试剂的 10 μM 盐酸多柔比星（Dox; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）。
  2. 持续灌注治疗剂溶液一段固定时间后，关闭阀门 VFin 并停止注射泵。将处理用注射器更换为含有凋亡检测试剂的新鲜培养基注射器，在显微镜下持续监测组织的同时，让新鲜培养基灌注 24–36 小时。

6. 时间序列显微镜观察及药物扩散系数的估算

为了获得最纯净的荧光数据，应将显微镜聚焦于组织的底层细胞来采集所有图像。由于在垂直方向上不存在营养梯度（见第4节），底层细胞能够很好地代表其上方所有其他层的细胞状态。

  1. 整个采集过程使用 IPLab 中的自定义脚本实现自动化BD Bioscience，美国马里兰州罗克维尔）。以10倍放大倍数每30分钟采集一次紧密堆积类球体的透射光和荧光图像（图3A）。在加入Dox之前，先采集背景荧光图像。由于腔室尺寸较大（1000 μm x 300 μm），获取两张相邻的图像并进行拼接4.
  2. 为了数学估算药物扩散系数，第一步是使用 ImageJ 生成阿霉素荧光的平均线性强度分布曲线。选择一个矩形感兴趣区域（ROI），覆盖微流控腔室中的组织。利用“Plot Profile”命令生成平均荧光强度随距流动通道距离变化的分布曲线。对最多 3 个不同的时间点重复此操作。
  3. 在加入Dox之前获取背景荧光图像，以测量组织的自发荧光。从获得的荧光强度曲线中减去平均背景荧光强度，并将每条曲线除以其对应的最大强度进行归一化，以获得 静力平衡 ΣFx=0 示意图，力的平衡分析，物理概念，矢量表示(x,t)（图3B）。
  4. 下一步是评估有效扩散系数 D 肿瘤组织内阿霉素（Dox）的扩散可通过以下方程表示5
    扩散方程 \( \tilde{c}(x,t) = \text{erfc}\left(\frac{x}{2\sqrt{D \cdot t}}\right) \) 公式。
    其中 erfc 是互补误差函数， x 是从通道到组织内部的距离，且 t 为加入Dox后的时间（参见图3）。在每个考虑的时间点使用以下迭代方案：
    • 猜测一个值 D
    • 在每个位置计算方程的右侧 x
    • 计算两侧之间的残差平方和
    • 修改 D 以减少残留
  5. 对每个时间点获得的D的最优值进行平均，以估算阿霉素（Dox）在组织中的平均有效扩散系数。

7. 代表性结果：

微流控装置提供了尺寸为 1 mm × 0.3 mm × 0.15 mm 的光学可及培养腔室，用于三维肿瘤组织的生长。多细胞肿瘤类球体被注入这些腔室，并由后端两个滤柱固定保留。悬滴法可使多个细胞系快速形成大小和形状均一的类球体。类球体在该装置上成功培养长达 3 天。腔室内的生长伴随着类球体内部微环境的可重复性改变。靠近流道区域的细胞凋亡较少，而组织深层的细胞凋亡水平较高。该装置被用于估算阿霉素在肿瘤组织中的扩散系数。测得的扩散系数为 8.75 × 10-7 cm2s-1，与先前报道的人类乳腺癌中 9.1 × 10-7 cm2s-1 的数值一致6。

细胞系所需细胞浓度孵育时间
LS174T300 cells/μL2-3 天
T47D750 cells/μL3-4 天
MDA-MB-231150 cells/μL5-6 天

表1. 悬滴法球状体的参数

部件描述
SF流动注射器
SP装柱注射器
VFin流动入口阀
VPin装柱入口阀
VFout流动出口阀
VPout装柱出口阀

表2. 流动装置中的注射器和阀门

培养室流动示意图，显示用于细胞生长的流体动力学装置，包括阀门和管路连接件。
图1. 流动装置示意图 VFin 和 VFout：流体入口和出口阀门；VPin 和 VPout：装载入口和出口阀门；SF 和 SP：流动和装载注射器。当类球体被注入培养室时，使用装载注射器以及装载入口和出口阀门；之后则使用流动注射器及流体入口和出口阀门来灌注培养基。

显示滤柱和培养基流动方向的球体培养室示意图。
图 2. 装置上培养室中被捕获球体的示意图。 一个球体随液体流入装置上的培养室，并被培养室后方的两根滤柱阻挡而滞留。

显示阿霉素扩散及荧光强度图的微流控装置。
图3. 装置中肿瘤组织内的阿霉素扩散。A. 组织透射光与红色荧光图像的叠加图，显示阿霉素（红色）的位置和浓度。比例尺为250 μm。B. 阿霉素荧光的归一化线性强度分布图。

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讨论

肿瘤中的血管系统稀疏且发育不良7,8。存在一些距离血管较远（>100 μm）的区域，无法通过血管系统获得营养物质和药物9。这种异质性微环境导致许多化疗药物的疗效受限10。本文开发的微流控装置在体外重现了具有增殖、静止以及凋亡或坏死细胞特征的异质性肿瘤微环境。靠近通道的细胞保持活性，但因扩散受限，在远离通道的区域形成营养缺乏并导致细胞凋亡。该流动通道模拟血管，而球形结构则代表肿瘤内邻近血管的一个小区域。

在将类球体引入装置时，需确保打孔的入口干净且无碎屑，因为任何对组织流动的阻碍都可能导致腔室填充失败或类球体断裂。在引入类球体的过程中，装填注射器需手动操作。流速必须尽可能保持最低，以避免将类球体推过腔室后方的支柱。与所有微流控装置一样，在操作过程中必须采取一定措施以避免系统中产生气泡，尤其是在更换注射器时。每次更换注射器时剪去一小段管路将有助于避免气泡的产生。

目前正在进行对设备的改进，以实现在单次实验中使用多个腔室和多种处理条件。 我们认为，这些设备可用于研...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院资助项目 # 1R01CA120825-01A1、马萨诸塞大学阿默斯特分校协作生物医学研究（CBR）项目以及对 Bhushan J. Toley 提供的伊森伯格奖学金的支持。我们衷心感谢 James Schafer 作为本视频的摄像师、解说员和编辑所做出的宝贵贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
硅胶弹性体试剂盒埃尔斯沃思胶粘剂184 型硅胶弹性体试剂盒
Miltex 活检穿孔器MedexSupplyMTX-33-31AA1.5 mm
PTFE 管Cole-ParmerEW-06417-310.032" ID
雄性鲁尔锁接头Qosina65111
带倒刺的雌性鲁尔锁接头Qosina11556
截止阀Idex Health and ScienceP-721
Y型连接器Idex Health and ScienceP-513
20G 1.5" 针BD 生物科学305176
胰蛋白酶-EDTAInvitrogen25300-054
HEPESSigma-AldrichH-4034
CaspGLOW 荧光素Biovision 公司K183-25
CaspGLOW 红色Biovision 公司K193-25
盐酸多柔比星Sigma-Aldrich44583
LS174TATCCCCL-188人结肠癌细胞系
T47DATCCHTB-133人导管癌细胞系
MDA-MB-231ATCCHTB-26人乳腺腺癌细胞系

参考文献

  1. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
  2. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).
  3. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
  4. Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro. Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).
  5. Walsh, C. L. A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics. Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).
  6. Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. A mathematical model of drug transport in human breast cancer. Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).
  7. Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions. Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).
  8. Brown, J. M., Giaccia, A. J. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy. Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).
  9. Thomlinson, R. H., Gray, L. H. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy. Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).
  10. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).

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