皂苷透化纤维制备结合呼吸测定法分析氧化磷酸化，可对线粒体功能进行整体性评估。生理和病理状态下的线粒体呼吸可反映多种调控因素的影响，包括线粒体间的相互作用、形态学特征及生物化学特性。
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摘要
摘要
线粒体功能的研究是心脏生理学的重要参数，因为线粒体参与能量代谢、氧化应激、细胞凋亡、衰老、线粒体脑肌病以及药物毒性等过程。鉴于此，测量心脏线粒体功能的技术备受关注。其中一种采用整合方法来测定线粒体功能的技术是呼吸测定法中的氧化磷酸化（OXPHOS）分析。
呼吸测定法评估氧化磷酸化（OXPHOS）的原理基于利用克拉克电极测量氧浓度。当透化的肌纤维束消耗氧气时，密闭腔室中的氧浓度下降。通过选用特定的底物-抑制剂-解偶联剂滴定方案，可将电子供给电子传递链的特定位点，从而评估线粒体功能。在进行线粒体功能的呼吸测定分析之前，需采用机械和化学预处理技术使肌纤维的肌膜透化。化学透化法利用皂苷选择性地穿孔细胞膜，同时保持细胞结构的完整性。
本文详细描述了制备皂苷透化心肌纤维以进行耗氧量测量、从而评估线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）功能的各个步骤。此外，还提供了故障排除建议，以及可用于检测电子传递链特定部位线粒体功能的特定底物、抑制剂和解偶联剂。重要的是，该实验方案可轻松应用于多种动物模型及人类样本的心肌和骨骼肌组织。
方案
1. 试剂制备
- 松弛与保存溶液（RP 溶液）按先前所述方法稍作修改制备1。简言之，RP 溶液包含 2.77 mM CaK2EGTA、7.23 mM K2EGTA、20 mM 咪唑、0.5 mM 二硫苏糖醇、20 mM 牛磺酸、50 mM K-MES、6.56 mM MgCl2、5.7 mM ATP、14.3 mM 磷酸肌酸，pH 调至 7.1（室温下调节）。用 0.45 μm 滤器过滤溶液以灭菌。分装为每份 15 mL（Falcon 聚丙烯管），于 -20 °C 保存。溶液配方参见讨论部分。
- 线粒体呼吸测定溶液（MiR05）按先前所述方法制备2，包含 0.5 mM EGTA、3 mM MgCl2·6H2O、20 mM 牛磺酸、10 mM KH2PO4、20 mM HEPES、1 g/L BSA、60 mM 钾-乳酸盐、110 mM 蔗糖，pH 调至 7.1（30 °C 下调节）。用 0.45 μm 滤器过滤溶液以灭菌。分装为每份 50 mL（Falcon 聚丙烯管），于 -20 °C 保存。溶液配方参见讨论部分。MiR05 在 30 °C 和 37 °C 下的氧溶解度系数为 0.923。
2. 组织制备
A. 心肌纤维的机械制备
- 实验程序已获得卡尔加里大学动物护理与使用委员会的批准，并遵循加拿大实验动物科学协会的实验指南。
- 首选颈椎脱位法以固定小鼠。也可选择腹腔注射（IP）氯胺酮和赛拉嗪（剂量分别为 80 和 10 mg/kg），或注射戊巴比妥钠 0.5 mg/kg。注意：戊巴比妥钠是 NADH 脱氢酶（复合物 I）的可逆性抑制剂4。
- 取出心脏并置于含有 RP 溶液、置于冰上的培养皿中（图 1A）。在解剖显微镜下仔细去除任何结缔组织和/或脂肪组织。
- 沿室间隔将心脏切成两半。从左心室的心内膜表面切取 10–25 mg 湿重（ww）的组织（图 1B）。确保切口方向与心肌纤维走向一致，以尽量减少对心肌的机械损伤。
- 将解剖所得的组织样本置于另一含有冰上 RP 溶液的培养皿中。在解剖显微镜下，沿纤维走向将心肌组织切成直径为 1–1.5 mm 的纵向条状。
- 用手术刀将条状组织截短至 2–4 mm 长度（图 1C）。
- 使用锋利的镊子并极度小心地进行机械分离，获得单个纤维束。最终的纤维束应最多包含 6–8 根纤维，通过小面积接触相连，湿重不超过 5 mg。推荐使用湿重为 1–3 mg 的心肌纤维。从外观上看，心肌组织颜色应由原来的红色变为浅粉色（图 1D）。
B. 心肌纤维束的化学制备
- 将12孔板置于冰上。
- 用RP溶液冲洗孔内组织，以尽量减少钙污染5。
- 将机械制备的肌纤维束转移至含有3 mL冰冻RP溶液（含50 µg/mL皂苷）的孔中。注意：皂苷的浓度不依赖于溶液中心肌组织的量。
- 在冰上轻轻搅拌孵育20分钟。
C. 心肌纤维束洗涤
- 用 MiR05 冲洗一个新样品池，以尽量减少钙污染5。
- 将心肌束转移至含有 10 mL 冰冷 MiR05 的新样品池中，在冰上轻轻搅拌孵育 10 分钟。
- 用新鲜 MiR05 重复步骤 (1-2) 2-3 次。重复洗涤的目的是确保彻底去除肌纤维束中的皂苷、ATP、ADP 以及任何残留的底物。
D. 湿重测定
- 在进行呼吸分析前，立即用镊子将单个肌纤维束（1-3 mg 湿重）置于吸水表面（滤纸）上轻轻吸干，持续按压约 5 秒或直至所有水分被吸尽，以获取湿重。
- 使用另一块吸水材料，去除镊子上残留的多余液体。
- 将天平归零，将肌纤维束置于塑料称量舟中进行质量测定。
- 将心脏肌纤维束转移至含有冰冷 MiR05 溶液的新孔中。此时肌纤维束已准备好用于耗氧量评估。
3. 呼吸测定法OXPHOS分析
A. 呼吸测量设备
- 实验室采用并推荐使用双室滴定-注射式氧电极仪（Oroboros Oxygraph2-k，Oroboros Instruments）。Oxygraph 2-k 通过采用可最大限度减少仪器自身耗氧背景（从而降低耗氧测量伪影）的硬件和软件（DatLab），实现了高分辨率的呼吸测定。
- 氧电极仪的校准是减少仪器耗氧干扰效应的关键步骤。校准方法因不同型号的氧电极仪而略有差异。具体操作步骤请参考仪器用户手册。
B. 代表性质量控制/技术验证方案
- 确保已将 MiR05 加入含有极谱氧传感器（POS）的氧电极测量室中，并在将小鼠心脏纤维放入氧电极测量室之前，给予足够时间使 MiR05 在 37°C 下充分饱和并达到空气平衡。
- 将心脏纤维样品置于氧电极测量室中搅拌的 MiR05 内。注意：确保使用 PVDF 或 PEEK 涂层的搅拌子（直径 6 mm）。
- 使用充满氧气的注射器，将氧电极测量室中的氧浓度提高至 250–550 µM。需注意，即使氧浓度达到空气饱和度的 1.5 倍，对透化纤维制备物而言，氧气浓度仍可能成为限制因素6。给予 5–10 分钟时间使氧浓度稳定。
- 使用 25 μL Hamilton 微量注射器，加入 10 μL 的 2 M 谷氨酸和 5 μL 的 800 mM 苹果酸，使其终浓度分别为 10 mM 和 2 mM。该滴定步骤用于测定复合体 I 支持的基础呼吸（状态 2；无 ADP 存在）。滴定后约 5 分钟内，氧通量应趋于稳定。良好的样品制备应能获得高度可重复的状态 2 耗氧量。
- 在稳定耗氧持续 2–5 分钟后，使用 25 μL Hamilton 微量注射器加入 20 μL 的 500 mM ADP，使其终浓度为 5 mM（饱和浓度），以测定通过复合体 I 的最大（状态 3）线粒体呼吸。尽管较少研究使用如此高的 ADP 浓度，但需注意，只有当 ADP 浓度超过 5 mM 时，才能达到 90% 以上的饱和度7。
- 在稳定耗氧持续 2–5 分钟后，使用 10 μL Hamilton 微量注射器加入 5 μL 的 4 mM 细胞色素 c，使其终浓度为 10 μM，用于评估外层线粒体膜（OMM）完整性的质量控制分析。
- 在稳定耗氧持续 2–5 分钟后，使用 10 μL Hamilton 微量注射器加入 1 μL 的 4 mg/mL 寡霉素，以抑制 ATP 合酶。该滴定步骤可用于验证内层线粒体膜的完整性。
- 完成呼吸测定法的 OXPHOS 评估后，保留样品用于干重测定或线粒体标志物分析。
- 从氧电极仪的玻璃测量室中移除 MiR05。用蒸馏水（ddH2O）至少清洗测量室三次。
- 用 100% 乙醇（EtOH）至少清洗测量室三次，以去除可溶于乙醇的抑制剂（如寡霉素）。
- 用 70% EtOH 清洗测量室三次，最后一次 70% EtOH 清洗需持续 30 分钟，以对氧电极测量室进行灭菌。
- 在为新的实验滴定方案加入 MiR05 前，确保含有 POS 的测量室已用 ddH2O 至少清洗五次。
- 验证性滴定可作为独立方案进行（图 2），也可根据呼吸测定研究的实验与诊断目标，整合至设计完善的滴定方案中。
4. 代表性结果：
通过图2所示的质量控制方案评估经适当制备的小鼠心脏纤维的耗氧量。图3-5提供了常见的心脏纤维制备不当的示例。呼吸控制比（RCR）是呼吸测定法中的一个重要指标，该参数反映了耗氧与氧化磷酸化之间的偶联程度。在透化纤维制备物中，RCR是指状态3相对于状态2的呼吸速率，或 alternatively 状态3与经寡霉素和/或乌氏毒素（ATR）诱导的状态4的比值。此外，RCR可作为质量保证的标志物，能够识别由实验性或病理性干预引起的偶联变化5。偶联良好的小鼠心脏透化制备物所产生的RCR通常在3-6之间，具体数值取决于所使用的孵育溶液1, 8, 9。
细胞色素 c 的滴定用于验证组织制备是否得当。细胞色素 c 是一种定位于线粒体内膜膜间隙的蛋白质10。当线粒体外膜完整时，内源性细胞色素 c 保留在膜间隙内，外源性细胞色素 c 的加入对呼吸作用影响极小（图2）。若线粒体外膜受损，内源性细胞色素 c 可从膜间隙释放，导致呼吸作用受到抑制，直至外源性细胞色素 c 的补充（图3）。合格的样品在加入细胞色素 c 后，氧通量应仅出现轻微上升，增幅范围在5-15%之间5。此外，该实验性滴定还可用于评估病理因素或实验性应激因子对线粒体外膜完整性的干扰。若观察到细胞色素 c 效应，应在线粒体制备过程中更加谨慎操作，和/或降低皂苷浓度。
添加寡霉素和/或ATR用于评估质子漏呼吸的改变，即不参与ADP磷酸化的耗氧量11。此外，该滴定步骤也可用于验证样品制备是否得当。对照组或野生型肌纤维应对该添加物敏感，并表现出显著的氧通量下降。若呼吸控制比（RCR）较低，且对寡霉素和/或ATR的敏感性降低，导致相对较高的氧通量，则提示在制备过程中线粒体内膜已受损（图4）。这种损伤可能发生在心肌纤维的机械分离过程中，因为与线粒体外膜相比，内膜对皂苷的损伤相对不敏感。然而，机械和化学制备条件均可能需要相应调整，以避免制备不当的心肌纤维5, 12。
来自小鼠的皂苷处理肌纤维束在RP溶液中放置不应超过6小时，在MiR05溶液中不应超过2小时。若出现如图5所示的对底物-抑制剂-解偶联剂滴定无反应的情况，可能提示孵育时间过长。后续实验应尽量缩短动物处死后至耗氧量测量之间的时间间隔。
图1. 小鼠心肌纤维束的机械制备。A. 解剖后立即获取的完整心脏。B. 左心室前壁10-25mg的组织样本。C. 将心肌组织分离成直径1mm、长度2-4mm的条状结构。D. 最终制备完成的心肌纤维束，可用于皂苷化学透化处理。
图 2. 利用极谱法评估获得的组织制备合格结果的代表性图示。状态2的氧通量由复合物I底物谷氨酸和苹果酸（M/G）支持，在加入ADP后显著增强（状态3）。外源性细胞色素c的添加无刺激效应，表明线粒体外膜完整。氧消耗对寡霉素的敏感性提示线粒体内膜完整性良好。2 mL密闭腔室中的氧浓度由蓝线标识。心脏组织样本在2 mL密闭腔室中的氧消耗由红线表示。苹果酸和谷氨酸，M/G；二磷酸腺苷，ADP；细胞色素c，Cyto c；寡霉素，o。
图3. 利用极谱法评估细胞色素c效应的验证实验。由复合物I底物谷氨酸和苹果酸（M/G）支持的状态2氧气通量在加入ADP后显著增强（状态3）。外源性细胞色素c添加后的刺激效应表明线粒体外膜完整性已受损。2 mL密闭腔室中的氧气浓度由蓝线标识。心脏组织样本在2 mL密闭腔室中的耗氧量由红线表示。苹果酸和谷氨酸，M/G；二磷酸腺苷，ADP；细胞色素c，Cyto c。
图4. 利用极谱法评估验证线粒体内膜完整性。状态2的氧通量由复合物I底物苹果酸和谷氨酸（M/G）支持，加入ADP后（状态3）氧消耗仅出现较弱的刺激。氧消耗对寡霉素反应性较差，提示线粒体内膜可能受损。2 mL密闭腔室中的氧浓度由蓝线表示；心脏组织样本在2 mL密闭腔室中的氧消耗由红线表示。苹果酸和谷氨酸，M/G；二磷酸腺苷，ADP；寡霉素，o。
图5. 在MiR05中长时间孵育后的极谱分析。外源性添加苹果酸和谷氨酸（M/G）对耗氧无影响，添加ADP后（状态3）的耗氧速率降低。外源性添加细胞色素c无刺激作用，且耗氧对外加寡霉素不敏感。对细胞外孵育液中添加物无反应，提示线粒体功能稳定性受损。2 mL密闭腔室中的氧浓度由蓝线表示，心脏组织样本在2 mL密闭腔室中的耗氧速率由红线表示。苹果酸和谷氨酸，M/G；二磷酸腺苷，ADP；细胞色素c，Cyto c。
1. 注意事项：试剂配制
100 mM K2EGTA 储存液的配制
| 试剂名称 | 终浓度（mM） | 克/100 毫升 H2O |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)N,N,N',N四乙酸（EGTA） | 100 | 3.805 |
| 氢氧化钾（KOH） | 200 | 1.15 |
注意：在室温下将 pH 调至 7.4。
100 mM Ca2EGTA 储备溶液的配制
| 试剂名称 | 终浓度 (mM) | g/100 mL H2O | 备注（可选） |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸 (EGTA) | 100 | 3.805 | 加热至 80°C 并轻微搅拌。 |
| 碳酸钙 (CaCO3) | 100 | 1.001 | 钙浓度必须精确，因为钙可调控包括线粒体在内的多种细胞器功能。确保所有 CaCO3 完全溶解，最终溶液必须完全透明。CaCO3 初始与 EGTA 及部分水混合，以促进碳酸和 CO2 挥发的形成。此反应可通过加热至最高 80 °C 加速。 |
| 氢氧化钾 (KOH) | 200 | 1.15 | 在 CO2 蒸发完成后用 KOH 中和。 |
注意：在室温下将 pH 调至 7.4。
弛豫与保存液（RP 溶液）的制备1
| 试剂 | 终浓度 (mM) | 每升用量 | 备注 |
| K2EGTA | 7.23 | 72.3 mL | |
| CaK2EGTA | 2.77 | 27.7 mL | |
| 咪唑 | 20 | 1.36g | |
| 二硫苏糖醇 | 0.5 | ||
| 牛磺酸 | 20 | 2.52g | |
| 腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物 (ATP) | 5.7 | 3.14g | |
| 磷酸肌酸 (PCr) | 14.3 | 4.0g | |
| 氯化镁 (MgCl2) | 6.56 | 0.624g | |
| K-MES | 50 | 14.0g |
注意：在室温下将 pH 值调节至 7.1
线粒体呼吸测定溶液（MiR05 溶液）的制备2
| 试剂 | 终浓度（mM） | 每升用量 | 备注（可选） |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA） | 0.5 | 0.190 g | 用作钙离子螯合剂 |
| 六水合氯化镁（MgCl2·6H2O） | 3.0 | 0.610 g | 无 Mg2+ 时无法检测纤维制备质量 |
| 牛磺酸 | 20.0 | 2.502 g | 牛磺酸是一种膜稳定剂和抗氧化剂，20 mM 是心脏细胞内的生理浓度 |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | 10.0 | 1.361 g | |
| HEPES | 20.0 | 4.77 g | |
| 乳酸硼酸钾（Potassium-lactobionate） | 60.0 | 120 mL 0.5 M K-乳酸硼酸钾 储液 | 0.5 M K-乳酸硼酸钾储液配制：将 35.83 g 乳酸硼酸加入 100 mL H2O 中，室温下调节 pH 至 7.0，再用 ddH2O 定容至 200 mL。用于模拟细胞内高 K+ 浓度。过去曾使用 KCl，但高浓度 Cl⁻ 会抑制线粒体肌酸激酶功能。 |
| 蔗糖 | 110.0 | 37.65 g | 用作活性氧（ROS）清除剂 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | 1 g/L | 1 g | 用作膜稳定剂、抗氧化剂，以及钙离子和游离脂肪酸的螯合剂 |
注意：在 30°C 下将 pH 调整至 7.1
3. 注意事项：呼吸测定法OXPHOS分析
B. 选择底物、解偶联剂和抑制剂
线粒体呼吸测定分析中选定底物列表
| 底物 | [储备液] | 准备 | 每 2 mL 体积 | [最终] | 评论 |
| 腺苷-5'-二磷酸单钾盐二水合物（ADP） | 500 mM | 246 mg/mL ddH₂O2O. 在室温下将 pH 调至 7.1。于 -80°C 在 250 μL 等分试样。 | 20 μl | 5 mM | 为了维持恒定的 Mg2++ 呼吸测定实验期间，加入 0.6 mol MgCl2/mol ADP |
| 抗坏血酸 | 800 mM | 0.1584 g/mL ddH₂O2O. 在 -20°C 在 200 μL 分装。避光 | 5 μL | 2 mM | 与TMPD平行使用时作为底物。必须校正自氧化引起的氧通量。 |
| 细胞色素C | 4 mM | 50 mg/mL ddH₂O2O. 储存于 -20°C 在 250 μL 等分试样 | 5 μL | 10 μM | |
| 羰基氰化物 对-(三氟甲氧基) 苯肼腙（FCCP） | 0.1 mM | 0.254 mg/10 mL 100% EtOH。储存于玻璃小瓶中，置于 -20°C 在 500 μL 等分试样。 | 步骤 1 μL | 作为解偶联剂。测定最大电子传递能力以及磷酸化系统对电子传递的任何限制。 | |
| 谷氨酸 | 2M | 0.3742 g/mL ddH₂O2O. 在室温下将 pH 调至 7.1。于 -20°C 在 250 μL 等分试样 | 10 μl | 10 mM | 作为NADH脱氢酶（复合物I）的底物。 |
| 苹果酸 | 800 mM | 0.1073 g/mL ddH₂O2O. 在室温下将 pH 调至 7.1。储存于 -20°C 在 250 μL 等分试样 | 5 μl | 2 mM | 作为NADH脱氢酶（复合物I）的底物。无法单独支持呼吸作用。 |
| 丙酮酸 | 1M | 11 mg/0.1 mL ddH₂O2O. 现配。 | 5 μL | 2.5 mM | 作为NADH脱氢酶（复合物I）的底物。 |
| 琥珀酸 | 1000 mM | 1.3505 g/5 mL ddH₂O2O. 在室温下将 pH 调至 7.1。于 -20°C 在 250 μL 等分试样 | 20 μl | 10 mM | 作为琥珀酸脱氢酶（复合体 II）的底物。 |
| N,N,N',N'-四甲基- pphenylenediamine 二盐酸盐（TMPD） | 200 mM | 47.1 mg/mL ddH₂O2O. 加入 0.8 M 抗坏血酸至终浓度为 10 mM，以防止自氧化，-80 °C 保存20°C 在 200 μL 等分试样 | 5 μL | 0.5 mM | 储备溶液自动氧化，表现为出现蓝色。与TMPD平行使用时可作为底物。必须对自动氧化造成的氧气通量进行校正。 |
线粒体呼吸测定分析中选用的抑制剂列表
| 底物 | [储备液] | 准备 | 每 2 mL 室体积 | [最终] | 评论 |
| 抗霉素A | 5 mM | 27.4 mg/10 mL 100% EtOH。储存于 -20°C 在 250 μL 等分试样 | 1 μL | 2.5μM | 辅酶Q：细胞色素抑制剂 c 氧化还原酶（复合体 III） |
| Atractyloside | 50 mM | 40 mg/mL ddH₂O2O. 储存在 -20°C 在 250 μL 等分试样 | 30 μL | 0.75 mM | ATP合酶抑制剂 |
| 寡霉素 | 4 mg/mL | 4 mg/mL 100% EtOH。储存于 -20°C 在 200 μL 等分试样 | 1 μL | ATP合酶抑制剂 | |
| 氰化钾 | 1M | 65.1 mg/mL ddH₂O2O. 新鲜配制，室温下将 pH 调至 7.1 | 1 μL | 1 mM | 细胞色素抑制剂 c 细胞色素c氧化酶（复合体IV）。利用随后的TMPD和抗坏血酸滴定来评估自氧化反应。 |
| Rotenone | 0.1 mM | 0.39 mg/10 mL 100% EtOH。储存于 -20°C 在 250 μL 分装。避光。 | 1 μL | 0.05μM | NADH脱氢酶（复合物I）抑制剂。然而，可能需要更高浓度才能减少鱼藤酮在腔室中的滞留，请按所述开始操作。 |
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讨论
皂苷透化心肌纤维技术在 体外 和 体内 线粒体OXPHOS耗氧量的评估。该技术的优势在于相较于分离的线粒体，其具有更高的生理相关性，因为细胞结构得以保留。尽管质膜被降解，但包括线粒体在内的细胞内膜结构仍保持完整。12, 14，肌浆网14，肌丝和细胞骨架 1, 17 保持完整。此外，线粒体与细胞骨架之间的相互作用1, 17 也保持不变。在透化的肌纤维中，线粒体表现出更高的稳定性。啮齿类动物的肌纤维样本可在冰冻保存液中保存6小时，而人类肌纤维样本的稳定性可达24小时。18,2线粒体与孵育溶液之间会发生快速平衡，从而可直接通过添加底物、抑制剂和解偶联剂来调控电子传递链的特定位点并进行分析。1, 5此外，这一点 原位 该技术仅需几毫克组织。
皂苷透化纤维技术的局限性不容忽视。心肌线粒体具有异质性，由两种亚群组成：肌膜下线粒体和肌原纤维间线粒体。原位线粒体呼吸测定法能够评估总体线粒体群体，...
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致谢
本研究由加拿大卫生研究院和基因组加拿大提供资助。JS 获得了阿尔伯塔医学研究遗产基金会、加拿大心脏与中风基金会以及加拿大糖尿病协会的薪金支持奖励。实验室感谢 Oroboros Instruments 在获取皂苷透化纤维技术过程中提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100% 乙醇 | Fisher Scientific | HC600 | |
| 70% 乙醇 | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| 腺苷5′′二磷酸腺苷单钾盐二水合物（ADP） | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| 牛血清白蛋白，基本不含脂肪酸–自由 | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| 抗霉素A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| 腺苷5′三磷酸腺苷二钠盐水合物（ATP） | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Atractyloside | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| 碳酸钙 | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| 羰基氰化对-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP） | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| 细胞色素c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| 乙二醇双(2-氨基–thylether)-N,N,N′，N′四乙酸（EGTA） | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| 谷氨酸 | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 咪唑 | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 氯胺酮 | 辉瑞制药有限公司 | Ketaset | |
| 乳糖酸 | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| 氯化镁（MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| 六水合氯化镁（MgCl₂·6H₂O）2∙6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| 苹果酸 | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’，N’四甲基对苯二胺二盐酸盐（TMPD） | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| 寡霉素 | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| 磷酸肌酸 | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 氢氧化钾 | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| 氰化钾 | Fluka | 60178 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| 戊巴比妥钠 | Ceva Sante Animale | 1715 138 | 浓度 54.7 mg/ml |
| 丙酮酸钠 | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| 琥珀酸 | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| 牛磺酸 | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| 赛拉嗪 | 拜耳集团 | 隆朋 | |
| ddH₂O2O | |||
| 冰 | |||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| Kimwipes | VWR国际 | 21905-026 | |
| 15 ml 聚丙烯离心管 | VWR国际 | 89004-368 | |
| 50 ml 聚丙烯离心管 | VWR 国际公司 | 89004-364 | |
| 直头珠宝镊 | George Tiemann & Co. | 160-50B | |
| 弯头珠宝镊 | George Tiemann & Co. | 160-57B | |
| 直型手术剪 | George Tiemann & 公司 | 105-402 | |
| 无菌手术刀片 | VWR 国际公司 | BD371610 | |
| 0.45-μm 注射器滤器 | VWR 国际公司 | CA28145-485 | |
| pH计 | VWR国际 | CA11388-308 | |
| 玻璃培养皿 | VWR 国际公司 | 89000-300 | |
| 12孔聚苯乙烯组织培养板 | VWR 国际公司 | 82050-926 | |
| 平板搅拌器 | VWR国际 | 97042-594 | |
| Fisherbrand 微量移液条 | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| 电子天平 | VWR 国际公司 | CA11278-162 | |
| 10μl Hamilton 微量注射器 | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μl Hamilton 微量注射器 | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μl Hamilton 微量注射器 | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Nalgene 挤压瓶 | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| 聚苯乙烯称量皿 | VWR 国际公司 | 89106-750 | |
| 解剖显微镜 | 奥林巴斯株式会社 |
参考文献
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
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