方法文章

清醒大鼠的高胰岛素-正常血糖钳夹技术

DOI：

10.3791/2432

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2011年2月7日

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, University of Calgary, 2Faculty of Kinesiology, University of Calgary

本文内容

摘要

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高胰岛素-正常血糖钳夹技术是评估胰岛素作用的“金标准”。通过以恒定速率输注胰岛素，促进葡萄糖的摄取。为抵消由此引起的血糖下降而输注的外源性葡萄糖量，可反映胰岛素敏感性。本文介绍在清醒、自由活动的大鼠中进行该操作的过程。

摘要

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2型糖尿病（T2D）的患病率正在迅速上升。该病以胰岛素分泌不足或无法有效利用所分泌的胰岛素为特征，导致血糖水平升高。评估胰岛素敏感性的“金标准”是高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术，又称胰岛素钳夹法。在此操作中，以恒定速率输注胰岛素，导致血糖下降。为了维持血糖水平稳定，需向静脉循环输注外源性葡萄糖（D50）。维持稳态所需的葡萄糖输注量可反映胰岛素敏感性。本文展示了在长期置管、无束缚且清醒的大鼠中实施的基本钳夹操作。该模型可在对动物造成最小应激的情况下采集血液样本。在麻醉诱导后，沿中线做切口，对左侧颈总动脉和右侧颈外静脉进行插管。插入的导管用肝素化生理盐水冲洗后引出体外并固定。动物在实验前需恢复4至5天，并每日监测体重变化。仅选用体重恢复至术前水平的动物进行实验。实验当天，大鼠禁食后连接至含有胰岛素和D50的输液泵。通过动脉导管测定基础血糖水平，并作为整个实验过程中的参考基准（正血糖状态）。随后，以恒定速率向静脉循环输注胰岛素。为抵消血糖的下降，开始输注D50。若D50输注速率高于机体葡萄糖摄取速率，则血糖将上升；反之，若输注速率不足以匹配全身葡萄糖摄取，则血糖将下降。通过持续调节葡萄糖输注速率，直至获得稳定的血糖读数。记录并报告此稳定期间的血糖水平和葡萄糖输注速率。所得结果可作为全身胰岛素敏感性的指标。该技术可根据特定实验需求进一步优化。结合使用放射性示踪剂，可进一步增强该方法的应用，以测定组织特异性的胰岛素刺激葡萄糖摄取以及全身葡萄糖转化速率。

方案

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A：动脉和静脉循环的外科插管

第一部分：动脉和静脉导管制备

  1. 截取15 cm的PE-50导管（内径0.58 mm (0.023")，外径0.965 mm (0.038")）。另截取一段1 mm长的硅胶管（内径0.76 mm (0.030")，外径1.65 mm (0.065")）作为固定珠。固定珠的作用是防止大鼠在置管后将导管拉出。
  2. 将显微解剖镊的尖端插入固定珠的管腔内，轻轻撑开镊尖以扩大开口。用另一对显微解剖镊将硅胶管沿管腔滑入固定珠中。使用高强度粘合胶（Loctite Super Glue）固定，确保固定珠平整地贴合在导管周围。将导管放置24小时使其完全干燥。
  3. 对于300克重的大鼠，动脉导管长度为距固定珠约2.7 cm，颈静脉导管长度约为3.2 cm。每增加100克体重，导管长度相应调整0.5 cm。切勿对导管末端进行斜面处理，以免插入时刺破血管。
  4. 手术前立即用肝素化生理盐水（10 U/mL）灌注导管，两端用不锈钢管塞密封后置于70%乙醇中消毒。插入前需进行空气干燥。

第二部分：手术准备

  1. 实验程序已获卡尔加里大学动物护理与使用委员会批准，并遵循加拿大实验动物科学协会的实验指南。以下程序均在成年雄性Sprague-Dawley大鼠（约300 g）上进行。所有操作均在异氟烷麻醉下实施，尽管也可使用注射类....

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讨论

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最初为研究人类胰岛素敏感性而开发的钳夹技术，现已适用于其他物种，包括实验大鼠和小鼠。研究胰岛素抵抗的动物模型，对于理解胰岛素敏感性的病理生理机制及相关疾病，以及发现具有临床价值的治疗干预手段具有重要意义1,2。已有多种方法被用于评估动物的胰岛素敏感性3，包括葡萄糖耐量试验（GTTs）和胰岛素耐量试验（ITTs）的不同变体4-6，以及基于空腹稳态条件推导出的胰岛素敏感性/抵抗性指数7-9。然而，当胰岛素敏感性是主要实验目标且技术可行性不受限制时，胰岛素钳夹法仍是金标准。本文介绍在清醒、自由活动的大鼠中实施的最基本的钳夹操作。胰岛素以恒定速率输注，同时根据需要调整外源性葡萄糖的输注速率，以维持血糖水平稳定。通过植入动脉和颈静脉导管实现对动物循环系统的通路。由于动物应激（操作）和麻醉会影响葡萄糖代谢和胰岛素敏感性，因此本操作采用并推荐使用能最大程度减少这些因素影响的模型。

胰岛素钳夹技术常用于糖尿病、心血管及药物研究。该操作的改进方法包括添加同位素示踪剂（放射性或稳定同位素），这些示踪剂具有强大功能.......

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披露

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实验程序已获卡尔加里大学动物护理与使用委员会批准，并遵守加拿大实验动物科学协会的实验指南。作者无任何利益冲突或披露事项。

致谢

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本研究由加拿大卫生研究院和基因组加拿大提供资助。JS 获得阿尔伯塔医学研究遗产基金会、加拿大心脏与中风基金会以及加拿大糖尿病协会的薪金支持奖项。特别感谢 David Wasserman 博士和 Bingle Bracy 向 Shearer 实验室传授该实验技术。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
管内聚乙烯导管（PE-50）Fisher Scientific14-170-12B内径0.58 mm（0.023"）× 外径0.965 mm（0.038"）
道康宁Silastic实验室导管Fisher Scientific11-189-15C内径0.76 mm（0.030"）× 外径1.65 mm（0.065"）
Tygon S-50-HL医用导管Harvard ApparatusPY2 72-1251内径3.2 mm（0.125"）× 外径4.7 mm（0.1875"）
乐泰超级胶水Grand Toy32237凝胶控制型
无菌外科刀片VWR internationalBD371610
弯头显微解剖镊George Tiemann & Co.160-20× 2
直头显微解剖镊George Tiemann & Co.160-15× 2
弯头止血钳George Tiemann & Co.105-1135× 2
直头止血钳George Tiemann & Co.105-1130× 2
止血钳尖端保护套Robbins Instruments, Inc.15.09-2-004
直头手术剪George Tiemann & Co.105-402
VENOJECT多采样Luer接头Terumo Medical Corp.810127A21号，1英寸
无菌导管导入器BD Biosciences406999
14号钝头针BD Biosciences51131014号，2英寸
无菌外科缝合线Johnson & Johnson1679H丝线，3-0号
非无菌外科缝合线Angiotech Pharmaceuticals, Inc.SP116丝线，4-0号
棉签VWR international10806-005
四层纱布垫VWR internationalCA43845-062
小型动物无线剪毛器Harvard Apparatus729063
异氟烷Halocarbon Products Corp.IPN-45
麻醉车Benson Medical Instruments
70%乙醇Fisher ScientificHC-1000
聚维酮碘消毒液Western Drug Distribution Center, Ltd.105267
Model 11 Plus注射泵Harvard Apparatus702208
不锈钢导管连接器Harvard Apparatus72-443423号，0.3英寸
不锈钢导管堵头Harvard Apparatus72-443623号，0.5英寸
不锈钢钝头针Instech Laboratories, IncLS2222号
60度Y型连接器Small Parts, Inc.STCY-22-0522号
CritSpin微型毛细管离心机Iris Sample ProcessingCS12
迷你离心机Fisher Scientific05-090-100
微量离心管VWR international53550-778
50 ml聚丙烯离心管VWR international89004-364
1 ml塑料滑动接头注射器BD Biosciences309602
3 ml塑料鲁尔锁接头注射器BD Biosciences309585
肝素抗凝注射液Western Drug Distribution Center, Ltd.102824制造商：LEO Pharma Inc. 浓度：1000 IU
EDTA溶液Promega Corp.V42310.5 M，pH 8.0
生理盐水Western Drug Distribution Center, Ltd.ABB7983154制造商：Hospira 0.9%氯化钠
50%葡萄糖Vétoquinol8DEX012D
Humulin-REli LillyHI-210100 U/ml
1 ml胰岛素注射器BD Biosciences309311
Fisherbrand* Hemato-Seal密封剂Fisher Scientific02-678
Fisherbrand*微量毛细管离心管Fisher Scientific22-362-574
One Touch Ultra测试条LifeScan, Inc.AW 085-314H
One Touch Ultra血糖仪LifeScan, Inc.AW 085-314B
戊巴比妥钠Ceva Sante Animale1715 138浓度：54.7 mg/ml
红色实验室标签胶带VWR international89097-932
蓝色实验室标签胶带VWR international89097-936
电子天平Fisher Scientific01-913-88
涡旋振荡器VWR international58815-234
计时器VWR international62344-641

参考文献

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  1. Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. Limitations to basal and insulin-stimulated skeletal muscle glucose uptake in the high-fat-fed rat. Am J Physiol Endocrinol Metab. 279, E1064-E1071 (2000).
  2. Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H.

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