清醒大鼠的高胰岛素-正常血糖钳夹技术

摘要

高胰岛素-正常血糖钳夹技术是评估胰岛素作用的“金标准”。通过以恒定速率输注胰岛素，促进葡萄糖的摄取。为抵消由此引起的血糖下降而输注的外源性葡萄糖量，可反映胰岛素敏感性。本文介绍在清醒、自由活动的大鼠中进行该操作的过程。

摘要

2型糖尿病（T2D）的患病率正在迅速上升。该病以胰岛素分泌不足或无法有效利用所分泌的胰岛素为特征，导致血糖水平升高。评估胰岛素敏感性的“金标准”是高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术，又称胰岛素钳夹法。在此操作中，以恒定速率输注胰岛素，导致血糖下降。为了维持血糖水平稳定，需向静脉循环输注外源性葡萄糖（D50）。维持稳态所需的葡萄糖输注量可反映胰岛素敏感性。本文展示了在长期置管、无束缚且清醒的大鼠中实施的基本钳夹操作。该模型可在对动物造成最小应激的情况下采集血液样本。在麻醉诱导后，沿中线做切口，对左侧颈总动脉和右侧颈外静脉进行插管。插入的导管用肝素化生理盐水冲洗后引出体外并固定。动物在实验前需恢复4至5天，并每日监测体重变化。仅选用体重恢复至术前水平的动物进行实验。实验当天，大鼠禁食后连接至含有胰岛素和D50的输液泵。通过动脉导管测定基础血糖水平，并作为整个实验过程中的参考基准（正血糖状态）。随后，以恒定速率向静脉循环输注胰岛素。为抵消血糖的下降，开始输注D50。若D50输注速率高于机体葡萄糖摄取速率，则血糖将上升；反之，若输注速率不足以匹配全身葡萄糖摄取，则血糖将下降。通过持续调节葡萄糖输注速率，直至获得稳定的血糖读数。记录并报告此稳定期间的血糖水平和葡萄糖输注速率。所得结果可作为全身胰岛素敏感性的指标。该技术可根据特定实验需求进一步优化。结合使用放射性示踪剂，可进一步增强该方法的应用，以测定组织特异性的胰岛素刺激葡萄糖摄取以及全身葡萄糖转化速率。

方案

A：动脉和静脉循环的外科插管

第一部分：动脉和静脉导管制备

1. 截取15 cm的PE-50导管（内径0.58 mm (0.023")，外径0.965 mm (0.038")）。另截取一段1 mm长的硅胶管（内径0.76 mm (0.030")，外径1.65 mm (0.065")）作为固定珠。固定珠的作用是防止大鼠在置管后将导管拉出。
2. 将显微解剖镊的尖端插入固定珠的管腔内，轻轻撑开镊尖以扩大开口。用另一对显微解剖镊将硅胶管沿管腔滑入固定珠中。使用高强度粘合胶（Loctite Super Glue）固定，确保固定珠平整地贴合在导管周围。将导管放置24小时使其完全干燥。
3. 对于300克重的大鼠，动脉导管长度为距固定珠约2.7 cm，颈静脉导管长度约为3.2 cm。每增加100克体重，导管长度相应调整0.5 cm。切勿对导管末端进行斜面处理，以免插入时刺破血管。
4. 手术前立即用肝素化生理盐水（10 U/mL）灌注导管，两端用不锈钢管塞密封后置于70%乙醇中消毒。插入前需进行空气干燥。

第二部分：手术准备

1. 实验程序已获卡尔加里大学动物护理与使用委员会批准，并遵循加拿大实验动物科学协会的实验指南。以下程序均在成年雄性Sprague-Dawley大鼠（约300 g）上进行。所有操作均在异氟烷麻醉下实施，尽管也可使用注射类麻醉剂。所有外科手术均需确保无菌技术。手术器械、烧杯和肝素化生理盐水均经高压灭菌处理。手术手套、注射器和棉签由供应商提供并已灭菌。
2. 称量大鼠并记录结果。体重数据在术后动物监测中至关重要。只有体重恢复至术前水平的动物方可用于后续实验。将大鼠置于麻醉箱中以3%异氟烷进行麻醉。手术期间通过鼻罩维持约2%异氟烷麻醉。手术必须在经过消毒、有利于维持无菌条件的区域进行。
3. 通过去除手术部位（颈部和肩胛骨区域）的毛发来准备动物。可使用小型毛发剪或化学脱毛剂。该操作应在与手术区域分开的空间内进行。
4. 将动物固定于手术台上。通过检查足部/眼部反射是否存在，确认动物已完全麻醉。使用适当的皮肤消毒剂准备手术部位（先用70%乙醇，再用聚维酮碘擦洗，最后再用70%乙醇）。

第3部分：手术

1. 在胸骨上方1 cm处沿中线做一小的纵行切口（用镊子沿中线纵向提起皮肤，用剪刀或手术刀切开）。
2. 使用显微解剖镊进行钝性分离，暴露左侧胸锁乳突肌。将该肌肉牵开，以显露约1 cm长的左侧颈总动脉。将显微解剖镊置于颈总动脉下方，固定动脉位置。轻柔剥离颈总动脉周围的结缔组织。重要的是在不损伤动脉或神经的前提下，将迷走神经与动脉分离。分离动脉后，用4-0丝线结扎近心端（该结扎线将在手术过程中用于操控颈总动脉）。注意：4-0缝线在使用前应以70%乙醇灭菌。
3. 用带齿显微解剖镊夹闭血管。用21号VENOJECT多采样Luer接头穿刺已结扎的远端。取出不锈钢管塞，借助无菌导管导入器小心插入导管，使其进入动脉。确认导管被镊子固定稳妥后，部分松开夹闭动脉的显微解剖镊，继续将导管推进至导管头端的珠状标记处。此时导管尖端应位于主动脉弓。注意切勿松开导管，否则血管压力会将其推出。
4. 在珠状标记下方牢固结扎两道4-0缝线，上方结扎一道，确认导管可正常采样。用含10 U/mL肝素的生理盐水冲洗导管通路。用不锈钢管塞重新封闭导管外端。
5. 利用同一手术切口，钝性分离暴露右侧颈外静脉。仔细分离后，用丝线结扎其近心端。用21号VENOJECT多采样Luer接头穿刺静脉。取出不锈钢管塞，借助无菌导管导入器将导管插入至珠状标记处，并在珠状标记下方结扎两道缝线。在珠状标记上方再结扎第三道缝线，确认导管可正常采样。用含10 U/mL肝素的生理盐水冲洗静脉导管通路。用不锈钢管塞重新封闭导管外端。
6. 将14号钝头针在皮下穿行，于肩胛骨之间背部皮肤做一新切口。将导管经钝头针引导，从背部穿出体外，使约4 cm导管外露。剪取0.5 cm长的Tygon S-50-HL医用管，套在两根外露导管上，并根据需要以胶带固定（静脉用蓝色，动脉用红色）。重新测试导管通畅性，用含150 U/mL肝素的生理盐水冲洗并充满导管，以防凝血。
7. 用3-0丝线缝合所有切口。将大鼠俯卧位置于预热的清洁笼内，食物放置于笼底。

B：术后护理

第一部分：术后即刻护理与监测

1. 当大鼠恢复完全的行走能力和清醒状态后，将其送回动物饲养设施。
2. 让大鼠恢复3至5天。
3. 每日监测感染、疼痛及体重变化情况。若观察到手术切口处有分泌物、整体精神萎靡和/或疼痛表现，则可能存在感染风险。疼痛的表现包括弓背姿势、背部毛发竖立凌乱，以及缺乏行走和/或进食行为。术后立即至术后三天内可能出现体重下降，但在5天内体重应趋于稳定和/或恢复至术前体重的±10%范围内。严重的体重减轻可能提示存在感染、中风和/或疼痛。
4. 每日重新测试导管，以确保其通畅性。

第二部分：维持导管通畅性

1. 术后恢复期间每天使用1 ml无菌滑动接头注射器吸取150 U/ml肝素化生理盐水，并在注射器前端安装一根22号钝头针。钝头针连接一段20 cm长的PE-50导管，导管另一端配有23号不锈钢管接头。
2. 将带有管接头的一端抬高至高于1 ml注射器其余部分的位置，推动液体以排除管路中的气泡。
3. 使用止血钳在大鼠体外动脉导管的塞子下方夹闭导管。
4. 使用另一把止血钳取下不锈钢导管塞。
5. 将连接注射器的管接头插入动脉导管中，并松开夹闭体外动脉导管的止血钳。
6. 回抽动脉导管内的血液至注射器中。若导管抽吸不畅，可极轻柔地推入少量冲洗液，以解除导管尖端可能嵌入血管壁的情况。当血液完全进入注射器时，表明导管已彻底通畅。
7. 在靠近1 ml注射器的位置夹闭PE-50导管，弃去该注射器。更换为一支装有新鲜150 U/ml肝素化生理盐水的新注射器。松开导管夹，将新注射器保持直立，用手指轻弹注射器，使可能出现的新气泡向上移动并远离管路。注意：必须格外小心，因气泡可能导致中风。
8. 注入150 U/ml肝素化生理盐水，直至导管内无血液残留，管路完全通畅。
9. 使用止血钳在大鼠体外动脉导管的管接头下方夹闭导管。将注射器连接装置从动脉导管上取下，并更换为不锈钢管塞。
10. 松开夹闭体外动脉导管的止血钳。
11. 对静脉导管重复上述操作。但由于静脉压力较低，采样往往无法实现。若150 U/ml肝素化生理盐水能够以极小阻力注入，则表明导管很可能已正确置于静脉内。

C：高胰岛素-正常血糖钳夹技术

第一部分：夹具的设置与准备

1. 称量大鼠并记录体重。该数据将用于确定胰岛素和葡萄糖输注速率。实验前至少禁食5小时，以确保动物处于餐后状态，并最大限度减少来自饮食的葡萄糖干扰。将大鼠置于带有垫料的小型容器或笼子中，限制其过度活动，但应保证其能够自由转身和理毛。
2. 按照图1所示设置管路和输注泵。P50连接管的长度如下：注射器至Y型接头为8 cm，Y型接头至大鼠为15 cm，动脉管路为20 cm，静脉管路为10 cm。移除不锈钢管塞，用含10 U/ml肝素的生理盐水冲洗颈静脉和动脉管路，分别确保采样和输注通畅。
3. 确定所需胰岛素体积。该体积取决于大鼠的胰岛素剂量和体重。本实验中，以2 µL/min的速度给予4 mU/kg/min的胰岛素，属于高生理剂量。应尽可能减少输注体积。胰岛素应适当稀释，并在血浆存在条件下给药。本实验室使用含3%大鼠血浆的生理盐水溶液稀释胰岛素。胰岛素为HumulinR 100 U/ml（Eli Lilly），也可使用其他速效胰岛素。在将稀释后的胰岛素装入输注注射器前，需充分混匀。
4. 准备50%葡萄糖溶液。可直接将其装入输注泵上的注射器中，并在泵上标记“葡萄糖”以避免后续混淆。请确保胰岛素和葡萄糖的供应量足以完成整个研究。通常钳夹实验可持续约2小时。本方案中使用3 mL注射器。
5. 将葡萄糖和胰岛素注射器安装至Harvard Apparatus Model 11 Plus注射泵上。推动葡萄糖至Y型接头处，用止血钳夹闭管路；推动胰岛素至接近动物端，同样用止血钳夹闭管路。夹闭所有管路，使大鼠在实验开始前静息30分钟。注意：建议使用带尖端保护的止血钳，以防永久性压扁管路。
6. 准备离心机及EDTA包被的采血管用于血浆收集。在本研究中，将在动物达到钳夹状态后额外采集血液样本。

第二部分：实验方案

1. 应采集基础胰岛素样本和血细胞比容样本。血细胞比容采样可确保实验过程中血液体积维持稳定。通常，血细胞比容水平不应低于初始值的10%。
2. 采集基础血糖样本（One Touch Ultra，LifeScan, Inc.），并确定需要维持的全血血糖水平。此处我们将血糖钳制在正常血糖水平，即5.0–5.5 mM（图2）。每次采血后，用少量含10U/ml肝素的生理盐水冲洗动脉导管，以防凝血。注意：输注前务必确保导管内无血凝块或气泡，否则可能导致动物发生中风。
3. 开始胰岛素输注。每5–10分钟采集一次血糖，监测每个时间点的血糖值。根据需要调整葡萄糖输注速率，直至达到稳态。该过程通常需通过反复尝试，可能耗时30分钟至>2小时。维持血糖稳态所需的葡萄糖量取决于实验方案、物种及所处条件（图2）。
4. 稳态血糖水平是指连续三次在规定范围内的血糖读数。此处，三次读数波动在约1 mM范围内即视为已钳制（例如：4.8、5.2、5.6 mM）。达到稳态后，记录维持血糖稳态30分钟所需的葡萄糖输注速率。在此期间可采集额外的血液样本。至少应再次采集一份血浆胰岛素样本和一份血细胞比容样本。
5. 完成钳夹实验后，动物可用于进一步检测，或实施安乐死并采集组织用于后续分析。根据动物情况，导管可保持通畅5–7天。

D：高胰岛素-正常血糖（胰岛素）钳夹实验结果

正确操作时，钳夹实验可评估大鼠的稳态胰岛素敏感性。在展示钳夹实验所得数据时，必须记录葡萄糖水平和葡萄糖输注速率。在至少30分钟的时间过程中，葡萄糖水平保持稳定（图3）表明已达到稳态。只有当全血葡萄糖浓度维持在约1 mM范围内时，才认为葡萄糖水平稳定。葡萄糖输注速率反映了为维持血糖稳定所需的外源性葡萄糖量。在可能的情况下，这些数据应以时间过程曲线表示，而非单一的平均值（图4）。

建议报告的其他指标包括血浆胰岛素和血细胞比容。测定空腹和钳夹期间的胰岛素水平，可确认胰岛素已成功给予，并能检测不同处理组之间胰岛素水平的差异（图5）。建议在实验开始前和胰岛素钳夹结束时均测量血细胞比容（图6）。这是为了确保实验过程中血细胞比容下降不超过5%，并防止伴随的血容量和血流变化对葡萄糖处置产生影响。

图1. 实验装置。图1显示了在钳夹过程中未受束缚且清醒的大鼠。导管可用于采血和输注，而无需抓取动物。左侧的泵分别含有胰岛素和葡萄糖。

图2. 夹闭过程中预期的数据。为了在基础水平（正常血糖，5 mM）实现夹闭，需调节外源性葡萄糖（D50）的输注速率，直至达到基础水平或“夹闭”状态。

图3. 夹钳实验中预期的血浆葡萄糖结果。当动物处于“夹钳”状态时，血糖在不同时间和实验组之间相对稳定。

图4. 夹闭实验中代表性的葡萄糖输注速率。维持正常血糖水平所需的外源性葡萄糖量存在差异。此现象通过对照组（普通饲料喂养）和高脂饲料喂养（胰岛素抵抗）动物进行说明。高脂饲料喂养的动物维持血糖水平所需的葡萄糖输注量较少，主要原因是其对输注的胰岛素不敏感。

图5. 大鼠具有代表性的血浆胰岛素水平。在胰岛素钳夹期间，血浆胰岛素水平应高于禁食状态下的基础血浆胰岛素水平。这可确保在胰岛素钳夹过程中胰岛素已正确给予动物。

图6. 红细胞压积的报告。必须获取并报告实验前的基础红细胞压积值以及实验后的红细胞压积值。这可确保因过度动脉采血导致的红细胞压积下降不超过基础值的5%。

讨论

最初为研究人类胰岛素敏感性而开发的钳夹技术，现已适用于其他物种，包括实验大鼠和小鼠。研究胰岛素抵抗的动物模型，对于理解胰岛素敏感性的病理生理机制及相关疾病，以及发现具有临床价值的治疗干预手段具有重要意义^1,2。已有多种方法被用于评估动物的胰岛素敏感性³，包括葡萄糖耐量试验（GTTs）和胰岛素耐量试验（ITTs）的不同变体^4-6，以及基于空腹稳态条件推导出的胰岛素敏感性/抵抗性指数^7-9。然而，当胰岛素敏感性是主要实验目标且技术可行性不受限制时，胰岛素钳夹法仍是金标准。本文介绍在清醒、自由活动的大鼠中实施的最基本的钳夹操作。胰岛素以恒定速率输注，同时根据需要调整外源性葡萄糖的输注速率，以维持血糖水平稳定。通过植入动脉和颈静脉导管实现对动物循环系统的通路。由于动物应激（操作）和麻醉会影响葡萄糖代谢和胰岛素敏感性，因此本操作采用并推荐使用能最大程度减少这些因素影响的模型。

胰岛素钳夹技术常用于糖尿病、心血管及药物研究。该操作的改进方法包括添加同位素示踪剂（放射性或稳定同位素），这些示踪剂具有强大功能...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
管内聚乙烯导管（PE-50）	Fisher Scientific	14-170-12B	内径0.58 mm（0.023"）× 外径0.965 mm（0.038"）
道康宁Silastic实验室导管	Fisher Scientific	11-189-15C	内径0.76 mm（0.030"）× 外径1.65 mm（0.065"）
Tygon S-50-HL医用导管	Harvard Apparatus	PY2 72-1251	内径3.2 mm（0.125"）× 外径4.7 mm（0.1875"）
乐泰超级胶水	Grand Toy	32237	凝胶控制型
无菌外科刀片	VWR international	BD371610
弯头显微解剖镊	George Tiemann & Co.	160-20	× 2
直头显微解剖镊	George Tiemann & Co.	160-15	× 2
弯头止血钳	George Tiemann & Co.	105-1135	× 2
直头止血钳	George Tiemann & Co.	105-1130	× 2
止血钳尖端保护套	Robbins Instruments, Inc.	15.09-2-004
直头手术剪	George Tiemann & Co.	105-402
VENOJECT多采样Luer接头	Terumo Medical Corp.	810127A	21号，1英寸
无菌导管导入器	BD Biosciences	406999
14号钝头针	BD Biosciences	511310	14号，2英寸
无菌外科缝合线	Johnson & Johnson	1679H	丝线，3-0号
非无菌外科缝合线	Angiotech Pharmaceuticals, Inc.	SP116	丝线，4-0号
棉签	VWR international	10806-005
四层纱布垫	VWR international	CA43845-062
小型动物无线剪毛器	Harvard Apparatus	729063
异氟烷	Halocarbon Products Corp.	IPN-45
麻醉车	Benson Medical Instruments
70%乙醇	Fisher Scientific	HC-1000
聚维酮碘消毒液	Western Drug Distribution Center, Ltd.	105267
Model 11 Plus注射泵	Harvard Apparatus	702208
不锈钢导管连接器	Harvard Apparatus	72-4434	23号，0.3英寸
不锈钢导管堵头	Harvard Apparatus	72-4436	23号，0.5英寸
不锈钢钝头针	Instech Laboratories, Inc	LS22	22号
60度Y型连接器	Small Parts, Inc.	STCY-22-05	22号
CritSpin微型毛细管离心机	Iris Sample Processing	CS12
迷你离心机	Fisher Scientific	05-090-100
微量离心管	VWR international	53550-778
50 ml聚丙烯离心管	VWR international	89004-364
1 ml塑料滑动接头注射器	BD Biosciences	309602
3 ml塑料鲁尔锁接头注射器	BD Biosciences	309585
肝素抗凝注射液	Western Drug Distribution Center, Ltd.	102824	制造商：LEO Pharma Inc. 浓度：1000 IU
EDTA溶液	Promega Corp.	V4231	0.5 M，pH 8.0
生理盐水	Western Drug Distribution Center, Ltd.	ABB7983154	制造商：Hospira 0.9%氯化钠
50%葡萄糖	Vétoquinol	8DEX012D
Humulin-R	Eli Lilly	HI-210	100 U/ml
1 ml胰岛素注射器	BD Biosciences	309311
Fisherbrand* Hemato-Seal密封剂	Fisher Scientific	02-678
Fisherbrand*微量毛细管离心管	Fisher Scientific	22-362-574
One Touch Ultra测试条	LifeScan, Inc.	AW 085-314H
One Touch Ultra血糖仪	LifeScan, Inc.	AW 085-314B
戊巴比妥钠	Ceva Sante Animale	1715 138	浓度：54.7 mg/ml
红色实验室标签胶带	VWR international	89097-932
蓝色实验室标签胶带	VWR international	89097-936
电子天平	Fisher Scientific	01-913-88
涡旋振荡器	VWR international	58815-234
计时器	VWR international	62344-641