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胃肠道动力监测仪（GIMM）

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DOI：

10.3791/2435

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2010年12月1日

 ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, The University of Vermont

本文内容

摘要

利用胃肠道动力监测仪（GIMM）评估豚鼠远端结肠的结肠动力，是一种简单易学的方法，可用于定量评估胃肠道的推进性动力。

摘要

胃肠道动力监测仪（GIMM；Catamount Research and Development；美国佛蒙特州圣奥尔本斯）是一种 体外 用于监测豚鼠远端结肠离体节段推进性运动的系统。该完整系统包括计算机、视频摄像机、带照明的器官浴槽、蠕动式加热循环水泵以及定制的GIMM软件，用于记录和分析数据。与传统的结肠蠕动监测方法相比，GIMM系统可实现对运动功能的连续、定量评估。将豚鼠远端结肠置于温热且充氧的Krebs溶液中，从口腔端插入粪便颗粒后，其沿结肠节段推进的速度约为2 mm/sec。系统可采集粪便颗粒移动过程的视频片段，并利用GIMM软件追踪粪便颗粒的运动进程。可获取整个结肠节段或任意特定感兴趣区域的推进性运动速率。除分析食团诱导的运动模式外，还可基于采集的视频片段构建时空图，以评估自发性运动活动模式。该系统的应用包括药理学评价受体激动剂和拮抗剂对推进性运动的影响，以及评估由炎症或应激等病理生理状态引起的运动功能改变。采用GIMM系统的豚鼠远端结肠推进性运动检测方法操作简便，易于掌握，为评估推进性运动提供了一种可靠且可重复的技术手段。

方案

1. GIMM 用结肠组织的制备

  1. 为准备用于胃肠道动力监测仪（GIMM）的远端结肠组织段，首先将分离的结肠置于冰冻的Krebs溶液（121 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 2.5 mM CaCl₂, 1.2 mM MgCl₂, 11.5 mM glucose, 15.5 mM NaHCO₃）中。2，1.2 mM MgCl2，25 mM NaHCO₃3，1.2 mM NaH2PO4，以及 8 mM 葡萄糖；用 95% O₂ 气体饱和2/5%CO₂2）。清除外壁残留的肠系膜，并在口腔端做一小切口，以便放入器官浴时易于辨认。注意：组织可在冰浴的克雷布斯液中保存最多2小时，然后再进行实验。
  2. 接下来，将流入和流出导管置于器官浴槽中，使其位于摄像视野之外，以避免干扰图像采集。持续用预热的（37°C) 氧合（95% O₂，5% CO₂）2) 以10 ml/min的流速灌注Kreb's溶液。
  3. 在记录口腔端与肛门端的前提下，将远端结肠的一段（至少5 cm）两端分别固定于器官浴槽中，保持轻微松弛，使肠段中段可自由移动达1 cm。口腔端应朝向研究人员，以便于放置粪便颗粒。在同一组实验中，每次实验的结肠段均应由同一研究人员以相同方式固定，因为肠段的长度和张力会影响推进性运动的速度，其中纵向拉伸会降低传输速率（Dickson 等, 2007).
  4. 让制备物平衡至少30 min。

2. 设置GIMM与数据采集

  1. 在GIMM系统中，灌流室内的结肠节段从下方进行照明。一台与计算机连接的数字摄像机位于灌流室上方。确保光源和GIMM软件均已开启。
  2. 在GIMM软件中设置新实验后，通过将一个环氧树脂包被的粪便颗粒插入结肠节段的口腔端以启动蠕动，从而开始第一次试验。单击计算机上的摄像机切换开关以打开摄像机，然后单击录制按钮开始记录。视频摄像机记录颗粒向肛门方向的运动，数字视频存储在计算机中以供后续分析。当颗粒到达结肠节段末端时，单击录制按钮停止记录。
  3. 为获得推进速率的对照值，使用来自健康动物的结肠节段，并且不施加任何药物。在单个组织制备中进行3-5次试验，每次试验之间留出5分钟的恢复期。
  4. 为确定特定条件或药物对结肠运动功能的影响，每种实验条件下对每个组织制备进行3-5次试验。此外，每项实验至少应在来自五只不同动物的五个不同结肠组织上进行。
  5. 在数字视频的分析中，粪便颗粒推进速率计算为颗粒通过结肠节段X cm所需的时间。

3. 时空图谱的构建

  1. 通过定制的 GIMM 软件，可将单次 GIMM 运行获取的数字视频转换为时空图。
  2. 在横轴上，通过将每帧视频中的结肠图像转换为轮廓，并沿整个长度计算并转换直径为灰度值，来绘制结肠直径随时间的变化。最终结果是，粪便颗粒和舒张区域呈现黑色，而收缩区域呈现白色。
  3. 粪便颗粒在结肠节段中移动的距离由纵轴表示。

4. 代表性时空图

  1. 图中所示为在不同实验条件下结肠节段内粪丸运动的代表性时空图。纵轴（y轴）表示粪丸随时间变化的位置，横轴（x轴）表示粪丸在结肠节段中推进的距离。

    电泳过程示意图，显示正常、停止和受阻导线状态。
  2. 在对照组结肠（未经处理、正常）的时空图中，粪丸以约 2 mm/sec 的速率线性推进。相比之下，给予某些药物或结肠发生炎症可导致运动模式紊乱，例如运动停止或推进受阻。
  3. GIMM 的结果也可用图形表示，其中纵轴表示粪丸行进的距离（单位：毫米），横轴表示时间（单位：秒）。例如，给予DAMGO（D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly-ol5）——一种阿片μ受体激动剂——可导致结肠推进性运动减弱。

讨论

由贝利斯和斯塔林在一个多世纪前首次描述了胃肠道中神经介导的推进性运动（Bayliss and Starling, 1899）。这一发现促使人们将肠道神经称为肠神经系统（ENS），即自主神经系统的一个独立分支（Langley, 1921）。神经源性肠道蠕动涉及在某一特定部位发生的牵张和/或黏膜刺激，并在刺激点上方或口腔侧引发反射性收缩，同时在肛门侧产生舒张。其结果是形成一个压力梯度，推动肠腔内容物从口腔侧向肛门侧移动。在多种物种的小肠以及大鼠的大肠中，可通过向肠段肠腔内灌注液体来诱发蠕动收缩波。在豚鼠远端结肠中，可将天然或人工粪便颗粒插入结肠的口腔端，并可轻松监测其在结肠节段中的推进过程。因此，豚鼠远端结肠为研究肠道推进性运动提供了一种简单而有效的检测方法。

蠕动是一种复杂的神经反射，涉及多种神经活性物质和受体。因此，影响肠神经系统（ENS）神经传递的化合物会改变推进性运动的速率。5-羟色胺主要由肠黏膜中的肠嗜铬细胞释放，参与启动蠕动反射。利用豚鼠远端结肠，Grider 及其同事证明，腔内给予 5-HT4 受体激动剂可增强推进性运动（Foxx-Orenstein 等., 1998；Grider 等., 1998），而浴槽中应用 5-HT3 和 5-HT4 受体拮抗剂则会降低推进速率（Kadowaki 等., 1996；Linden 等., 2003b）。此外，使用选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）阻断5-羟色胺转运体在低浓度时可增加蠕动，但在高浓度时反而减少蠕动，这可能是由于5-HT受体脱敏所致（Kadowaki 等., 1996；Wade 等., 1996）。其他参与豚鼠推进性运动的信号分子包括作用于烟碱型受体的乙酰胆碱，后者是肠道中间神经元信号传递的主要介质。使用烟碱型受体拮抗剂六甲铵阻断突触传递在高浓度时可减缓粪丸推进，而较低浓度则不影响推进速率（Kadowaki 等., 1996）。阿片类物质及阿片受体激动剂长期以来已知对胃肠道运动具有抑制作用，在豚鼠推进性运动模型中可降低粪丸推进速度（Foxx-Orenstein 等., 1998；Wood 等., 2009）。有趣的是，大建中汤（daikenchuto）是一种在日本临床上用于治疗呕吐、胃痛和运动功能紊乱的传统草药制剂，当其与阿片受体拮抗剂纳洛酮联合使用时可降低粪丸推进速率，单独使用时则引起逆向蠕动（Wood 等., 2009）。这些发现表明，豚鼠推进性运动模型在评估各种化合物及其受体对结肠运动模式影响方面的有效性。

多项研究表明，炎症会导致结肠神经元的电学特性和突触特性发生改变（Linden et al., 2003a；Lomax et al., 2005），并且这些改变在炎症恢复后仍可持续数周（Krauter et al., 2007；Lomax et al., 2007）。利用GIMM系统可在豚鼠远端结肠中研究结肠炎诱导的神经可塑性变化对推进性运动功能的影响。相比传统监测结肠运动的方法——即仅通过测量粪便颗粒移动一定距离所需时间来评估推进性运动功能，该系统具有多项优势。以往关于结肠炎症诱导神经可塑性的研究显示，颗粒推进速度有所下降（Linden et al., 2003a；Linden et al., 2005），但近期采用GIMM系统的研究揭示了更为复杂的变化（Strong et al., 2010）。例如，在远端结肠炎症区域发生溃疡的部位，颗粒推进速率降低，而在邻近区域运动功能反而加快，这一现象是早期“秒表法”未能发现的。其他研究还表明，在炎症活动期出现的运动功能障碍可通过抑制COX-2得以恢复（Linden et al., 2004），但在炎症消退后仍持续存在的运动功能改变则对COX-2抑制不敏感（Krauter et al., 2007）。此外，在这些较新的研究中，GIMM系统生成的时空图谱揭示出一种逐步推进的结肠运动模式，该模式在炎症后动物中被观察到，并有助于解释推进速率降低的现象。

总之，豚鼠远端结肠推进性运动测定法是一种高通量检测手段，可用于评估受试化合物及病理状态对结肠运动功能的影响。此外，GIMM 系统为评估结肠推进性运动提供了一种简单直接的方法。 体外它能够连续测量颗粒推进情况，并生成时空图以研究自发性活动模式。与传统方法相比，该方法还能产生更复杂的可量化现象，且由于数据以数字文件形式保存在系统中并易于访问，可进行多种方式的重复分析。

披露

本视频的制作由 Catamount Research and Development, Inc 赞助，该公司生产了本文所用的仪器。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
克雷布斯液’
异氟烷麻醉剂Webster Veterinary
环氧树脂涂层粪便颗粒天然豚鼠粪便颗粒，经干燥后用环氧树脂（黑色指甲油）包被
镊子Fine Science Tools
显微剪刀Fine Science Tools
不锈钢针
烧杯500 mL
气体钢瓶95% O2/5% CO2
计时器
胃肠道动力监测仪Catamount Research and Developmenthttp://www.catamountresearch.com/products/gimm.htm

参考文献

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