巨囊突触膜电容记录的膜片钳方法

摘要

我们演示了在亨氏巨大突触（calyx of Held）——一种哺乳动物中枢神经系统的神经末梢——进行突触前膜片钳记录的基本技术。

摘要

我们演示了在亨氏巨大突触（calyx of Held）——一种哺乳动物中枢神经系统的神经末梢——进行突触前膜片钳记录的基本技术。对突触前末梢的电生理记录可测量动作电位、钙离子通道电流、囊泡融合（胞吐作用）以及随后的膜回收（内吞作用）。含有神经递质的囊泡发生融合时，其囊膜会并入亨氏巨大突触的细胞膜中。这种细胞膜面积的增加可通过电容的上升来检测。随后电容的下降则反映内吞作用，即细胞膜从突触膜上回收或移除的过程。内吞作用对于维持亨氏巨大突触的结构完整性至关重要，同时也为生成新的、可填充神经递质以供后续胞吐事件使用的囊泡所必需。在亨氏巨大突触进行电容记录，使得研究人员能够在哺乳动物中枢神经系统神经末梢中直接且快速地测量囊泡释放及其后续的内吞过程。此外，通过成对记录技术，还可同时测量相应的突触后电活动。因此，利用该实验体系可获得中枢神经系统突触处突触前与突触后电活动的完整图景。本文介绍了脑片制备方法、亨氏巨大突触的形态学鉴定特征、基本的膜片钳技术，以及利用电容记录测量胞吐和内吞作用的实例。

方案

膜片钳设置：

光学： 光学系统对于寻找合适的细胞以及确定其位置至关重要。

尽量获得清晰的细胞图像：边缘清晰，细胞外观柔和。

扫描整个视野，寻找带有附着耳蜗核巨细胞的优良MNTB主细胞。旋转培养皿，从不同角度观察耳蜗核巨细胞。初期可在气球状终末上进行练习。

挑选切片表面或第2层的细胞^nd 细胞层。靶向最前面的1/3^rd 用移液器处理细胞

鉴定耳蜗囊： 寻找双层膜结构（见图1），并通过旋转切片皿从不同角度观察，以确认其为耳蜗囊。

图 1

 

花萼深度：花萼应位于表面或尽可能接近表面。

用于封接的表面： 使用显微镜上的微调旋钮来确定囊状结构的“宽度/深度”。例如，微调旋钮旋转~10%的幅度即可提供足够的表面区域用于封接。

封接突触前细胞： 要达到细胞附着状态，需在移液管内施加正压（约0.15 psi），观察细胞表面出现“微小”变形；使用操纵器上下、左右移动移液管，并可轻触突触前末梢表面，以获得良好的变形效果；随后释放压力，必要时施加负压吸引。

PULSE，数据采集程序：

首次使用前以及根据采样容量需要时，均需增加缓冲区大小。

每次都需要加载修改后的宏。

液接电位：Presyn记录液为-11 mV（负11 mV）。

突触前：Cslow≈15 pF

突触前 Rs 补偿：10 μsec，65%（在不产生振荡的情况下，可能实现更高的补偿）

在记录电容之前：测试电流弛豫（10 mV，10 毫秒阶跃），以判断弛豫是否为单指数型，即突触前末梢是否可用单个区室模型来描述。

滤波器设置：在弛豫测量期间，分别将贝塞尔滤波器1和滤波器2设置为30 kHz和10 kHz，以确保不会遗漏快速组分。

在记录微小事件时，Xinsheng 使用了 10 kHz 和 5 kHz 的滤波设置。LGW 要求我仅使用设定在 30 kHz 的滤波器 1，以确保能够准确测量微小事件的上升时间。

文件命名规则：7 位数字 000mmxx，其中 mm 代表月份（或月份和年份），xx 代表细胞编号。

清洗溶液管路： 实验结束时，用 20 ml 0.1 M HCl 清洗管路，随后用 200 ml ddH2O 冲洗。

外部溶液被循环使用，泵速为 20-30 rpm。

（溶液从浴室腔室回流至量筒中）。

设置3条出水管线以确保足够的吸力。

移取突触前记录液：约310毫渗透压摩尔（milli Osmolar）

Presyn 溶液的渗透压需约为 310 mOsm，以防止实验过程中 R-access 增加。

突触前电极内液与突触后电极内液不同（例如，突触前液含有ATP和GTP）。

TTX-TEA 溶液（用于分离钙电流）：

• 尽量在封接或破膜形成后施加溶液，因为溶液中的四乙铵（TEA）会阻断钾离子通道并使细胞去极化，这对细胞不利。出于同样原因，使用河豚毒素（TTX）后可能无法再次利用该脑片。
• 比较细胞或脑片的初始反应与最终反应，以检测长时间去极化是否产生影响。
• 河豚毒素（TTX）使用浓度为 1 μM 而非 0.5 μM，以便更快地产生效应，从而在更换溶液后等待时间更短。

切片

振动切片机设置：

• 70 Hz 侧向振动
• 振幅：1.0 mm
• 切片时前进速度：带有壶腹时为 0.01–0.02 mm/sec，其余情况下为 0.1 mm/sec；厚度：180 μm（老年动物约 150 μm）

切片在37ºC下孵育1小时（包括切割时间），即切割后在浴液中放置15-20分钟。

移液器：

突触前：最初为 3.5–4.5 MΩ，操作更熟练后为 3.0–3.5 MΩ

使用拉制仪手册设置参数。由于玻璃管较厚，需使用延迟功能（延迟值设为200或1均可）

玻璃类型：硼硅酸盐，标准壁厚，无细丝

外径：2.0 mm

内径 1.16 mm

长度：7.5 cm