利用斑马鱼模型评估宿主免疫在分枝杆菌感染中的作用

摘要

来源： 卢克宁，H. 等 建立结核病模型 Mycobacterium marinum 感染的成年斑马鱼。 视频实验杂志 (2018).

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 实验性M. marinum感染的腹腔注射方法

1. 将5 µL稀释后的细菌溶液用移液器滴加到一片石蜡膜上，然后用30 G胰岛素针头吸取液滴。
2. 使用5–8月龄的野生型斑马鱼和rag1−/−hu1999突变型斑马鱼进行实验。在含有0.02% 3-氨基苯甲酸乙酯（pH 7.0）的养殖用水中麻醉成年斑马鱼。将鱼腹侧朝上置于湿润的泡沫塑料切口内固定。
   注意： Rag-/- 突变型鱼类无法进行体细胞重组，因而不能产生有功能的T细胞和B细胞。
3. 在腹鳍之间以大约45°角插入针头。保持针头开口朝上，以确保整个开口进入腹腔内。缓慢注入细菌悬液，然后小心拔出针头。
   注意： 若注射后红色示踪剂从鱼体泄漏，应将该鱼排除在实验之外。
4. 注射后立即把鱼转移到装有新鲜养殖水的恢复缸中。
5. 每15分钟从正在使用的细菌分装液中取样，接种于7H10平板，于29 °C培养5天，通过计数平板上的菌落验证感染剂量。
6. 定期检查鱼类的健康状况，并对出现感染症状的鱼类使用浓度超过0.02%的3-氨基苯甲酸乙酯（pH 7.0）实施安乐死。
   注意： 大约7%的成年斑马鱼在感染34 ± 15 CFU、30%的斑马鱼在感染2029 ± 709 CFU后，会在8周内出现症状19。症状可能包括异常游动、对触碰无反应、喘息、水肿或明显的消瘦。
7. 按照常规标准饲养和维护斑马鱼

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
海分枝杆菌	美国模式培养物集存库	ATCC 927
Middlebrook 7H10 琼脂	BD, 赛默飞世尔科技	11799042
Middlebrook OADC 增菌液	BD, 赛默飞世尔科技	11718173
Middlebrook 7H9 培养基	BD, 赛默飞世尔科技	11753473
Middlebrook ADC 增菌液	BD, 赛默飞世尔科技	11718173
磷酸盐缓冲液片剂（PBS）	西格玛-奥德里奇	P4417-50TAB
酚红	西格玛-奥德里奇	P3532
27 G 针头	Henke Sass Wolf	4710004020
1 mL 注射器	Henke Sass Wolf	4010.200V0
Omnican 100 30 G 胰岛素针头	Braun	9151133
3-氨基苯甲酸乙酯（pH 7.0）	西格玛-奥德里奇	A5040