体外平行板流动模型用于研究细菌在组织活检样本上的黏附

摘要

来源：Ditkowski, B.，等。一种用于研究细菌对移植物组织黏附的体外平行板灌注系统模型。J. Vis. Exp. （2019）。

本视频展示了使用平行板流动腔的方法，将荧光标记的细菌灌注于血管移植物组织上，从而在剪切流动条件下实现对细菌黏附及早期致病过程的可控分析。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核和批准。1. 使用平行板流动腔进行体外灌注实验

1. 将直径为10 mm、厚度一致的组织活检样本固定于流动腔系统中，使内表面朝上，以便与细菌悬液接触。
   注意：不同移植物保持相同的组织厚度，可确保通道内达到一致的组织高度，从而在所有条件下实现层流。流动腔系统的各个组件详见图1。
   1. 开始实验时，将圆形组织样本置于带有8 mm圆形穿孔的载玻片与橡胶垫圈之间。
      注意：该载玻片具有超薄底部薄膜，可用于形成8 mm的孔洞。载玻片与橡胶垫片共同固定组织，使样本可直接接触流动培养基，同时防止实验过程中活检组织移位。暴露于流动环境的组织表面（直径较小）不得用镊子触碰。
      1. 将带有组织的支架插入腔室底部金属框架中嵌入的垫圈片内。
      2. 将上部金属框架及其对应的垫圈片与已插入组织支架的腔室底部连接，随后使用八个螺钉和螺母固定整个腔室。确保各移植物之间的腔室高度始终保持一致。
         注意：腔室高度应在拧紧螺钉后测定。可使用卡尺或直尺进行测量。
2. 使用管路将流动腔与蠕动泵及液体储液瓶连接。
3. 通过蠕动泵（流速4 mL/min），以37 °C恒温的400 mL细菌储液瓶（自行设计，图1）向组织灌注含10⁷ CFU/mL（经CFU（菌落形成单位）计数验证，并关联OD₆₀₀（光密度）测定结果）的荧光标记细菌PBS（磷酸盐缓冲盐水）悬液，剪切应力为3 dyne/cm² （达因每平方厘米压力单位），持续1小时（使用平板恒温器调节温度，材料表）。
4. 使用同一收集储液瓶连续循环100 mL细菌悬液。
5. 灌注结束后，拆卸腔室以取出移植物，并在12孔板中用4 mL PBS洗涤组织样本两次，每次3分钟，使用实验室轨道摇床进行振荡洗涤。随后使用较小直径的皮肤活检打孔器切割移植物的内部区域。
6. 将每块组织活检样本分别放入含有1 mL无菌0.9% NaCl的14 mL离心管中。标记为#1管。
7. 使用超声波清洗仪处理10分钟（振幅=100%，频率=45 kHz），使细菌从组织上完全脱离。
   注意：应通过将组织片段在TSB（胰蛋白胨大豆肉汤）液体培养基中37 °C过夜培养后测定OD₆₀₀，并与经无菌溶液处理的对照组片段比较，评估细菌是否完全从组织移植物上脱离。

结果

图1： 一种新开发的流动腔系统（自主设计）示意图。A. 流动腔（1），其尺寸为长×宽×高：125 mm × 55 mm × 18 mm（通过螺钉与螺母组合将腔体各部件固定在一起并施加压力） 通过 （1）垫圈上的金属框架，用于防止泄漏；（2）柱体上部；（3）上部垫片板，带有两个孔用于固定管路连接件，通过管路系统将流室与泵和液体储...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛心包（BP）补片，柔软型Peri-Guard心包	Synovis Surgical Innovations, USA	PC-0404SN
牛颈静脉导管（BJV）	Contegra导管；Medtronic Inc, USA	M333105D001
CH冷冻保存同种异体移植物	欧洲同种异体移植物库（EHB）	-
Acu-Punch穿孔器	Acuderm Inc, USA	P850（8 mm）；P1050（10 mm）
人血清白蛋白	Flexbumin；Baxter, 比利时	BE171464LOT:16G12C
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）	Fluka, 施泰因海姆, 德国	22092-500G
心浸液肉汤（BHI）	Fluka	53286-500G
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	14190-094
5(6)-羧基荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯（CF）	Sigma-Aldrich, 德国	21878-100MG-F
蠕动泵（型号 ISM444B）	Ismatec BVP-Z Standard；Cole Parmer, 沃特海姆, 德国	631942-2
超声波清洗仪	VWR超声波清洗机；VWR, 拉德诺, 宾夕法尼亚州	142-6044	230V/50 -60Hz 60VA；HF45kHz, 30W
ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher旗下Invitrogen	P36930
Arium Pro VF - 超纯水 - H2O MilliQ	Millipore	87206462
显微镜载玻片 - 组织培养腔室（单孔）	Sarstedt	94.6140.102
Lumox可拆卸单孔培养皿	Sarstedt	94.6150.101
不锈钢外科刀片	Swann-Morton	311
Tygon硅胶管，1/8"内径 × 1/4"外径	Cole-Parmer	EW-95702-06	温度范围：–80 至 200°C；灭菌方式：环氧乙烷、γ射线辐照，或15 psi压力下高压灭菌30分钟
PharMed BPT管路	Saint-Gobain	AY242012	可高压灭菌，121°C下30分钟
Tygon LMT-55管路	Saint Gobain Performance Plastics™	15312022
恒温器	BMG BIOMEDIZINTECHNIK	300-0042	230V, 90VA, 50Hz