本方案描述了一种基于活性的检测方法，用于检测培养上清液或体液中的基质金属蛋白酶。
本文内容
摘要
摘要
基质金属蛋白酶（MMPs）是一类含锌的内肽酶，通过切割肽键降解蛋白质。目前已鉴定出二十余种MMPs，根据其结构和底物特异性可分为六类（胶原酶、明胶酶、膜型MMP（MT-MMP）、基质溶解素、基质金属蛋白酶-7（matrilysins）及其他）。MMPs在细胞侵袭、软骨降解、组织重塑、伤口愈合及胚胎发生中发挥关键作用，因此既参与正常生理过程，也参与多种疾病的发病机制，如类风湿性关节炎、癌症和慢性阻塞性肺疾病1-6。本文将重点介绍广泛表达的MMP-2（明胶酶A，IV型胶原酶），并演示如何通过1980年由C. Heussen和E.B. Dowdle首次报道的一种常用、简单但极为敏感的技术——明胶酶谱法（zymography）——检测细胞培养上清中的MMP-27-10。该技术为半定量方法，因此当在同一凝胶中加载已知浓度的重组MMP作为参照时，可用于测定待测样本中的MMP水平11。
含有基质金属蛋白酶（MMPs）的溶液（例如细胞培养上清液、尿液或血清）被加样至含有十二烷基硫酸钠（SDS；用于使蛋白质线性化）和明胶（MMP-2 的底物）的聚丙烯酰胺凝胶中。样品缓冲液的设计目的是增加样品黏度（便于加样）、提供示踪染料（溴酚蓝；用于监测样品迁移）、提供变性分子（使蛋白质线性化）以及调节样品的 pH 值。随后，在电泳缓冲液中施加电流，使蛋白质在恒定迁移速率下进行迁移。迁移距离与蛋白质的分子量呈负相关（小分子蛋白质比大分子蛋白质在凝胶中迁移更快，因此迁移得更远）。电泳结束后，将凝胶置于复性缓冲液中，使蛋白质恢复其三级结构，这是酶活性所必需的。接着将凝胶转移至显影缓冲液中，以允许蛋白酶降解其底物。显影缓冲液中还含有对氨基苯基汞乙酸盐（APMA），用于将无蛋白水解活性的前体 MMPs（pro-MMPs）激活为具有活性的 MMPs。下一步是对底物（本例中为明胶）进行染色。洗去凝胶上多余的染料后，蛋白酶降解区域呈现为透明条带。条带越透明，表明其所含蛋白酶浓度越高。随后可通过密度测定法（例如使用 ImageJ 软件）测定条带染色强度，从而实现样品间的比较。
方案
1. 上样并运行凝胶电泳
- 所有样品必须经过适当处理，以保持酶的活性，并在采集后立即使用，或在 -80°C 下冷冻保存。样品中不得含有还原剂（如 β-巯基乙醇），且在上样前不得煮沸。
- 打开装有凝胶的夹心盒袋，用去离子水冲洗夹心盒。
- 移除夹心盒底部的保护胶带以及凝胶顶部的梳子。
- 用电泳缓冲液（用去离子水稀释至1X）冲洗加样孔三次。
- 将凝胶放入Mini-Cell中，确保夹心盒较小的一侧朝内。用凝胶固定楔锁紧位置。Mini-Cell可同时平行运行一个或两个凝胶。
- 向顶部（内侧）腔室加入1X电泳缓冲液，液面需高于加样孔，检查是否存在泄漏。若发现泄漏，应倒出缓冲液并重新放置凝胶。
- 向底部腔室加入1X电泳缓冲液。
- 在其中一个加样孔中加入10 μL蛋白分子量标记物。
- 将等体积的上样缓冲液与样品混合，使用上样枪头（每个样品之间需更换枪头）加入凝胶的加样孔中。每个加样孔最多可加载20 μL总体积。
- 将盖子盖上Mini-Cell，并将电极线连接至电源。打开电源，设定为恒压125 V，运行90分钟。观察底部腔室导线上是否产生微小气泡，以确认电流流通。
- 首次运行凝胶时，应每隔15分钟监测一次电泳进程，以上样缓冲液中含有的溴酚蓝作为指示剂。待指示染料迁移至凝胶底部时，停止电泳。
2. 凝胶的复性与显影
- 每块凝胶分别准备 100 mL 1× 变性缓冲液和 200 mL 变性缓冲液，均使用去离子水配制。
- 当溴酚蓝示踪染料迁移至凝胶底部时，关闭电源，打开 Mini-Cell，取出凝胶。使用凝胶刀（或药匙）将夹板的两侧分开，并切去一角以标记凝胶的方向。
- 小心将凝胶从夹板中取出，放入盛有 100 mL 复性缓冲液的容器中。室温下轻柔振荡孵育 30 分钟。
- 吸除复性缓冲液，向凝胶中加入 100 mL 显色缓冲液。室温下轻柔振荡孵育 30 分钟。
- 吸除显色缓冲液，再向凝胶中加入 100 mL 显色缓冲液。于 37°C 孵育过夜（16–18 小时）。
- 吸除显色缓冲液，在室温下用去离子水轻柔振荡洗涤三次，每次 5 分钟。
- 扫描凝胶，记录蛋白标准品条带的精确位置，因为这些条带在后续染色后可能变淡或不可见。
- 向凝胶中加入 20 mL SimplyBlue Safestain 进行染色。室温下轻柔振荡孵育 1 小时。
- 吸除 SimplyBlue Safestain 染色液，用 100 mL 或更多去离子水在室温下轻柔振荡脱色 1 小时。
- 为获得更佳结果，更换新鲜去离子水，继续在室温下轻柔振荡孵育 1 小时或更长时间。
3. 数据分析
- 小心地将凝胶从水中取出，并放入塑料文件保护套中。
- 以300 dpi或更高的分辨率扫描凝胶。将图像保存为TIFF格式（图1A）。
- 使用ImageJ（或其他类似软件）测量条带强度。
- 在ImageJ中打开TIFF文件（图1A）。
- 通过选择“Image>Type>8-bit”将图像显示为黑白模式（图1B）。
- 使用矩形选择工具勾勒第一条条带，绘制的矩形高度至少应为宽度的两倍（此为软件要求）。
- 按下“1”键或选择“Analyze>Gels>Select first lane”，该条带将被自动勾勒。
- 会出现一个新的矩形，将其移动到下一条条带，然后选择“Analyze>Gels>Select next lane”。重复此步骤，直至所有条带均被选中（图1B）。
- 按下“3”键或选择“Analyze>Gels>Plot lanes”，生成每条条带的轮廓图（图1C）。
- 使用直线选择工具（通常已自动选中），绘制基线，使目标峰成为一个完全封闭的区域。
- 选择魔棒工具，点击每个峰内部以选中该峰。
- 选择“Analyze>Gels>Label peaks”，获得包含每个选中峰面积的表格。这些数据可直接作图（图1D），也可相对于某一选定条带的数值进行归一化处理。当汇总多个重复凝胶的数据以确定结果的统计学显著性时，此归一化步骤尤为重要。
4. 典型结果
我们展示了一块凝胶，其中11个加样孔加载了含有不同浓度MMP-2的细胞培养上清液（图1A）。直接观察该凝胶可明显看出某些加样孔之间MMP-2浓度存在显著差异。例如，可以清楚地看到，第4和第5孔中的MMP-2含量远高于第11孔，甚至高于第10孔。为了对条带进行客观定量，我们使用ImageJ软件进行了密度测定（图1B-D），结果证实第11孔与第4和第5孔之间的MMP-2含量差异约为4倍，而第10孔与第4和第5孔之间的MMP-2含量差异约为2倍。
图1. 明胶酶谱法检测MMP-2。A，明胶凝胶的扫描图像。凝胶顶部标示了加样孔编号。B，与A相同的凝胶以黑白形式显示，用于密度测定。在ImageJ中用矩形框选每个条带。C，对应于A和B图凝胶的两个密度测定曲线示例（条带#4和#11）。在每个峰的基部画一条直线，形成封闭区域。D，A和B图凝胶条带峰面积在归一化前（左）和归一化后（右）的图示，归一化依据为条带#1的密度。
图2. 本图展示了酶谱法如何用作一种半定量技术。我们在连续7个加样孔中加载了系列稀释样本（1:1梯度稀释），并分别测量了pro-MMP-2和MMP-2条带的密度。
讨论
我们已展示了如何对细胞培养上清液中的MMP-2进行酶谱分析。
上样量需根据样品来源及目标基质金属蛋白酶（MMP）的经验值确定。上样量过少将导致无法检测，而过多则可能引起信号饱和，因为蛋白酶在条带区域可降解的底物量有限。如有必要，可在加入上样缓冲液前用去离子水稀释样品，或将孵育时间从过夜缩短至4小时。也可使用浓缩装置（例如 Millipore 货号 # UFC803024）对溶液中的蛋白质进行浓缩。如果条带仍难以观察，可能需要延长凝胶孵育时间，甚至可达48小时。在处理组织培养上清样品时，需注意胎牛血清（及其他血清）中含有MMP，可能影响实验结果。因此，我们均在无血清培养基中培养后收集上清液。
方案中第2.9和2.10段所述的洗涤步骤旨在去除消化条带的背景染色。延长洗涤时间可进一步降低背景，但也会减弱整个凝胶中底物的染色强度。若需延长洗涤时间，建议每隔几小时扫描一次凝胶，以选择对比度最佳的图像。
该技术也可用于检测其他基质金属蛋白酶（MMP）。例如，MMP-9 可在明胶凝胶上被检测到，而 MMP-1、MMP-8 和 MMP-13 也可在一定程度上被检测，因为明胶并非它们的首选底物。MMP-1 和 MMP-13 最好通过胶原蛋白酶谱法进行检测，而酪蛋白是 MMP-11 的首选底物，同时也可用于检测 MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-12 和 MMP-139。 当 MMP-7（基质溶解素）和胶原酶（MMP-1 和 MMP-13）在酪蛋白或明胶凝胶中含量较低时，检测较为困难。在上样时向样品中添加肝素，可显著提高 MMP-7 的检测灵敏度。而对于 MMP-1 和 MMP-13，需在电泳开始后将肝素加入凝胶中12。
由于zymography在酶变性并复性后测定其酶活性，因此可检测样品中所有基质金属蛋白酶（MMPs）的活性，包括酶、酶原以及与内源性抑制剂（如TIMP-2）结合的酶。然而，通过比较活性酶与酶原条带的密度，可以确定样品中MMP的活化程度，其中酶原的分子量略高。
仅靠酶谱法通常不足以鉴定基质金属蛋白酶（MMP）。将MMP的迁移位置与已知分子量的标准蛋白进行比较有助于鉴定，但需注意，某些标准蛋白含有还原剂，当在非还原条件下使用时，可能导致显示的分子量不同9。一种可行方法是在同一凝胶中加载可溶性重组MMP作为对照。然而，MMP可能与其他蛋白结合，从而改变其表观分子量。在显影缓冲液孵育过程中，可将特异性MMP抑制剂加入凝胶（或将凝胶一分为二，仅在其中一半加入），作为药理学工具用于鉴定目标MMP。建议结合第二种技术（如Western印迹、免疫细胞化学或ELISA）辅助鉴定目标MMP。需要注意的是，Western印迹的检测灵敏度通常远低于酶谱凝胶，使用该技术时可能导致假阴性结果。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢贝勒医学院分子与细胞生物学系的 S. Ressler 博士建议使用蛋白浓缩器来提高细胞培养上清液中基质金属蛋白酶（MMPs）的浓度。
本项目获得了克拉拉·埃尔德·怀特·格雷厄姆捐赠研究基金和美国国立卫生研究院/国家关节炎与肌肉骨骼及皮肤病研究所（NIH/NIAMS，项目编号AR059838）向CB提供的资助。本内容仅由作者负责，不一定代表NIH的官方观点。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Xcell SureLock Mini-Cell CE 标志电泳装置 | Invitrogen | EI0001 | |
| 电源（型号 302） | VWR international | 93000-744 | |
| Novex 10% 明胶zymogram凝胶，1.0 mm，12 孔 | Invitrogen | EC61752BOX | |
| Blue Juice 凝胶上样缓冲液 | Invitrogen | 10816015 | |
| 凝胶上样吸头 | VWR international | 53509-015 | |
| 蛋白质分子量标准品 | Invitrogen | LC5800 | |
| Novex Tris-甘氨酸-SDS 电泳运行缓冲液 | Invitrogen | LC2675 | |
| Novex zymogram 复性缓冲液 | Invitrogen | LC2670 | |
| Novex zymogram 显色缓冲液 | Invitrogen | LC2671 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Epson Perfection 4490 Photo 扫描仪 | Amazon | n/a | |
| ImageJ 软件 | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | 作者：W. Rasband，NIH/NIMH |
参考文献
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