基于阴离子交换树脂的生物气溶胶病毒检测

摘要

来源：Schaeffer, J. W., Chandler, 等. 利用阴离子交换树脂从生物气溶胶中检测病毒。 J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了使用阴离子交换树脂从生物气溶胶中检测病毒的方法。采用含有该树脂的液体冲击式采样器从空气中捕获病毒。收集树脂后，用含有载体RNA的病毒裂解缓冲液进行处理。将裂解产物转移至微量离心管中，用于病毒RNA的提取，随后通过qRT-PCR扩增并确认病毒的存在。

方案

1. 核酸提取与定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测

1. 直接从阴离子交换树脂中分离核酸，并出于比较目的，也从液体冲击器所用的液体中分离核酸。本示例描述的是RNA提取流程，但类似方案也可用于DNA病毒。
   1. 从阴离子交换树脂中提取核酸。
      1. 将液体冲击器中含阴离子交换树脂的全部液体转移至一个无菌的50 mL锥形管中。
      2. 静置使树脂沉降，缓慢倾倒去除上清液。使用1 mL移液枪头吸除阴离子交换树脂中残留的所有液体。
      3. 从病毒RNA提取试剂盒中加入560 µL含有载体RNA的病毒裂解液，直接加入阴离子交换树脂中，在室温下孵育10分钟，期间定期混匀。
      4. 使用1 mL移液枪头将病毒裂解液（即病毒裂解缓冲液）转移至一个无菌的1.5 mL锥形管中，随后按照病毒RNA提取试剂盒的说明书进行RNA提取操作（参见材料表），唯一不同之处在于使用60 µL洗脱缓冲液将RNA洗脱至终体积60 µL。
   2. 从液体冲击器中提取核酸。
      1. 吸取140 µL液体样本至一个无菌的1.5 mL锥形管中，使用病毒RNA提取试剂盒进行RNA提取，操作步骤遵循制造商说明书，唯一不同之处在于使用60 µL洗脱缓冲液将RNA洗脱至终体积60 µL。
         注意：140 µL是本实验所用特定病毒RNA提取试剂盒在单步操作中可处理的最大样本体积。
2. 进行qRT-PCR（定量反转录聚合酶链式反应），用于检测雄性特异性2型（MS2）fRNA大肠杆菌噬菌体以及甲型和乙型流感病毒。本实验中，使用5 µL核酸洗脱液进行qRT-PCR。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Escherichia coli 噬菌体 MS2 (ATCC 15597-B1)	美国典型培养物保藏中心	ATCC 15597-B1
FluMist 四价流感疫苗	阿斯利康	联系制造商	该疫苗的病毒成分每年可能有所变更
CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统	Bio-Rad	1855195
引物与探针	Integrated DNA Technologies	NA
0.2 µM 无菌滤器	NA	NA
1 L Pyrex 玻璃瓶或同等产品	NA	NA
1 mL 移液枪吸头	NA	NA
1 mL 移液器	NA	NA
50 mL 刻度移液管	NA	NA
PCR 管	NA	NA
移液辅助器或同等设备	NA	NA
QIAamp 病毒 RNA 小量提取试剂盒	Qiagen	52904
QuantiTect 探针法 RT-PCR 试剂盒	Qiagen	204443
Amberlite IRA-900 氯化型	Sigma-Aldrich	216585-500G
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
水（分子生物学级别）	Sigma-Aldrich	W4502-1L
Eppendorf DNA LoBind 微量离心管	ThermoFisher	13-698-791
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	ThermoFisher	14-432-22
Falcon 聚丙烯离心管	ThermoFisher	05-538-62
SuperScript III Platinum 一步法 qRT-PCR 试剂盒（含 ROX）	ThermoFisher	11745100
SKC Biosampler 20 mL 三件套玻璃采样器	SKC 公司	225-9593
Vac-u-Go 样品泵	SKC 公司	228-9695
Collison 六喷嘴雾化器	BGI 公司	NA
HEPA 滤芯	PALL	12144
Q-TRAK 室内空气质量监测仪 8554	TSI 公司	NA
Alnor AVM440-A 热式风速计	TSI 公司	NA
SidePak AM510 个体气溶胶监测仪	TSI 公司	NA
生物气溶胶实验舱	NA	NA