利用神经球实验建立小鼠胚胎神经干细胞培养

摘要

本视频方案演示了如何利用神经球实验从胚胎第14天小鼠脑的神经节隆起中分离并扩增神经干细胞。

摘要

在哺乳动物中，干细胞作为未分化细胞的来源，在动物整个生命周期中维持不同组织和器官的细胞生成与更新。它们具有替代因衰老、损伤或疾病而丢失细胞的潜力。神经干细胞（NSCs）的存在最初由Reynolds和Weiss（1992）在成年哺乳动物中枢神经系统（CNS）中通过一种新型无血清培养系统——神经球检测法（neurosphere assay, NSA）首次描述。利用该检测方法，也可从胚胎期中枢神经系统的不同区域分离并扩增神经干细胞。这些 体外 扩增的神经干细胞（NSCs）具有多向分化潜能，可分化为中枢神经系统（CNS）的三种主要细胞类型。尽管神经球培养法（NSA）看似操作简单，但为获得可靠且一致的结果，必须严格遵循本视频所展示的各项操作步骤。本视频以胚胎第14天（E14）小鼠脑组织为材料，实际演示了NSA的操作流程，用于生成并扩增神经干细胞，并提供了实现可重复性神经球培养的关键技术细节。该操作流程包括：获取E14小鼠胚胎、显微解剖分离脑组织中的神经节隆起区、在神经干细胞培养基中将所获组织解离成单细胞悬液，最后将细胞接种于NSA培养体系中。培养5至7天后，获得的原代神经球可进行传代，以进一步扩增神经干细胞数量，用于后续实验。

方案

1. 解剖前的基本准备：

1. 通过将 NeuroCult NSC 基础培养基与 NeuroCult NSC 增殖添加剂按 9:1 的比例混合，配制适量的完全 NSC 培养基。
2. 将培养基置于 37°C 水浴中预热。
3. 为解剖和清洗操作准备含高浓度抗生素（10%）的冷 HEPES 缓冲最低必需培养基（HEM）。 alternatively，也可使用添加抗生素的 NSC 基础培养基完成此步骤。
4. 将含抗生素的冷 HEM 25–30 mL 分装至无菌的 50 mL 离心管中，用于胚胎收集。
5. 需要准备数个 10 cm 塑料培养皿，用于在解剖过程中盛放胚胎和脑组织，以及存放已解剖的组织。
6. 用于取出胚胎（大剪刀、小尖头剪刀、大镊子、小弯头镊子）或进行胚胎脑解剖（小镊子、弯头精细镊子、45° 角精细镊子和小剪刀）的手术器械，需使用玻璃珠灭菌器在 250°C 下灭菌，或采用其他可用的高压灭菌方法进行灭菌。
7. 用 70% 酒精擦拭解剖显微镜，并将其置于超净台或 PC2 级生物安全柜内进行设置。

2. 收集 E14 小鼠脑组织并进行显微解剖：

1. 一只交配时间明确的怀孕小鼠在第14天被麻醉^th 根据所在机构批准的动物实验方案中的规定进行妊娠期操作。
2. 颈椎脱位用于确保动物不会遭受疼痛和痛苦。
3. 将麻醉后的小鼠仰卧于吸水纸巾上，用70%乙醇清洗腹部以消毒该区域。
4. 用大号镊子夹住腹部皮肤，然后用大剪刀剪开皮肤及皮下筋膜，暴露腹腔和子宫角。
5. 使用小型镊子和剪刀取出子宫，并将其转移至含有冷HEM的50 ml锥形管中。
6. 将子宫组织转移至超净台，然后用足量新鲜无菌的冷HEM溶液冲洗一至两次，以去除可能的污染物（如血液和毛发）。
7. 将子宫组织转移至含有冷 HEM 的 10 cm 培养皿中。
8. 使用小型弯头镊子和剪刀打开子宫角，将胚胎转移至一个新的含有冷HEM的10 cm培养皿中。
9. 将胚胎头部在颈段脊髓水平分离，并转移至另一含有冷HEM的培养皿中。
10. 将培养皿转移至解剖显微镜下，以取出颅骨中的脑组织。
11. 用精细的弯头镊子从头部尾侧夹住，使头部背侧朝上。使用显微剪刀，首先在眼睛上方做一水平切口，然后沿中线从额头向头后部继续剪开。注意要剪透皮肤和颅骨，避免损伤下方的脑组织。
12. 使用弯头镊子将切开部位的边缘向后推动，从而将脑组织从颅骨中取出。重复此操作，直至所有脑组织均从颅骨中移除。
13. 使用弯头镊子固定大脑，使背侧朝上，然后用显微剪刀从每侧半球的嗅球向后沿皮层做切口，直至半球后部，以暴露神经节隆起。
14. 使用一把弯头镊子和一支45° 另一手持有角度的镊子，撑开皮层的切开瓣膜，分离出神经节隆起。
15. 将解剖得到的组织置于无菌的10 cm培养皿中，并重复此操作，直至所有脑组织完成显微解剖。
16. 使用1 mL移液器吸头吸取1 mL NSC培养基收集组织块，并转移至15 mL离心管中。
17. 然后通过将移液枪头轻压至管底并反复吹打悬液，充分但轻柔地解离组织，以将细胞团块分散为单个细胞。吹打操作进行3-4次，直至形成乳白色悬液。随后静置悬液1-2分钟，使未完全解离的团块沉淀。
18. 将几乎全部的细胞悬液转移至另一离心管中，然后向残留的细胞团块中加入1 mL NSC培养基，按前述方法将其解离为单细胞。
19. 将各管内容物合并，在室温下以700 rpm（110g）离心5分钟。
20. 吸除上清液至接近实际沉淀，然后将细胞重悬于1 mL完全NSC培养基中。
21. 用移液器轻轻吹打培养基，以获得均匀的单细胞悬液。
22. 10 μ细胞悬液的 L 与 90 混合 μ加入 L 型台盼蓝进行细胞计数。
23. 最后，将细胞以 2×10² 的密度接种⁵ 细胞/毫升，置于添加了20纳克/毫升表皮生长因子（EGF）的完全NSC培养基中。T25培养瓶使用5毫升培养基，T75培养瓶使用20毫升，T175培养瓶使用40毫升。
24. 神经球在37℃培养5-7天后形成° 在含5% CO₂的湿润化培养箱中₂6-7天后，细胞球直径应达到150-200微米，即可进行传代培养（传代）。

3. 胚胎神经干细胞的传代与扩增：

1. 当神经球准备进行传代培养时（直径为 150–200 μm），将含有悬浮神经球的培养基从培养瓶中移出，转移至适当大小的无菌组织培养管中，在室温下以 700 rpm（110 g）离心 5 分钟。
2. 弃去上清液，将神经球重悬于 1 mL 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液中。
3. 将细胞悬液置于 37°C 水浴中孵育 2–3 分钟，随后加入等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂以终止胰蛋白酶活性。
4. 轻轻吹打细胞悬液，确保胰蛋白酶已完全失活。
5. 将细胞悬液以 700 rpm（110 g）离心 5 分钟，弃去上清液后，将细胞重悬于 1 mL 完全 NSC 培养基中。
6. 取 10 μL 细胞悬液与 90 μL 台盼蓝混合，进行细胞计数。
7. 将细胞以 5×10⁴ 个细胞/mL 的浓度接种于完全 NSC 培养基中，培养基中添加 20 ng/mL EGF，并根据培养瓶规格使用相应体积：T25 培养瓶使用 5 mL 培养基，T75 使用 20 mL，T175 使用 40 mL。
8. 在 37°C、含 5% CO₂ 的湿润化培养箱中孵育 5–7 天后，可形成次级神经球。

4. 代表性结果：

在原代胚胎神经干细胞（NSC）培养中，大多数细胞在接种后会变得肥大并贴附于组织培养皿上。尽管大部分细胞会在2-3天后死亡或发生分化，但仍有增殖能力的细胞会形成小的细胞簇，并从基质上脱落（图1）。在培养最初48小时内形成的较大球形聚集体不应被误认为是原代神经球。聚集体的形成主要取决于培养物中碎片及未充分解离的组织团块的含量。真正的神经球在相差显微镜下透光性好、亮度高，且随着体积增大而变得更加球形（图2）。存活且健康的神经球外表面可见细小的微突起（图3）。培养5-7天后，神经球应呈圆形但不致密，直径应在150至200之间 μ直径约为 m。如果神经球培养时间过长（培养 9–10 天后），可能会因球体中心细胞死亡而形成聚集体或颜色变深（参见视频）。过大的神经球最终可能开始分化 原位 （附着于基质并向外围迁移）。此外，大神经球的解离及传代培养也较为困难。

图1. 贴壁后第3天的原代E14神经干细胞（NSC）培养。箭头所示为增殖中的NSC细胞簇。原始放大倍数：20×

图2. 接种后7天的原代E14神经干细胞培养。原始放大倍数：10倍

图3. 接种后第5天的E14代次1神经球。注意神经球边缘的微突起（箭头所示）。原始放大倍数：20倍

讨论

神经球培养法是分离与扩增神经干细胞的首选方法 ^1-5 由于其操作简便且可重复性强，该检测方法是大规模生成未分化中枢神经系统前体细胞的宝贵工具，这些细胞可用于 体外 和 体内 研究。需要强调的是，神经球既可由真正的神经干细胞产生，也可由更为局限的前体细胞产生。因此，仅通过计算神经球形成频率会高估任何特定神经细胞群体中真正神经干细胞的数量 ⁶为准确评估真正神经干细胞（NSCs）的频率，强烈建议使用专为此目的开发的神经集落形成细胞检测法（Neural Colony Forming Cell Assay, N-CFCA）。⁷.

为了获得稳定且高质量的E14神经干细胞神经球培养，我们建议：

1. 在开始收获胚胎前，准备好所需的物品。
2. 在整个解剖过程中，将胚胎保持在低温的HEM或基础NSC培养基中。
3. 应尽快完成解剖操作（1小时内），因为组织随着时间推移会变软并具有黏性，增加解剖难度。
4. 不要让细胞球生长过大。通常应根据...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NeuroCult NSC 基础培养基	培养基	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC 增殖添加剂	培养基添加剂	Stem Cell Technologies	05701
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	试剂	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
大豆胰蛋白酶抑制剂	试剂	Sigma-Aldrich	T6522
青霉素-链霉素（Pen/Strep）	试剂	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
*MEM	试剂	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	HEM 组分
*HEPES	试剂	Sigma-Aldrich	H4034	HEM 组分
*蒸馏水	试剂	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
细胞筛	筛具	BD Biosciences	352340
T25 培养瓶	培养器皿	Nalge Nunc international	136196
T80 培养瓶	培养器皿	Nalge Nunc international	178905
15 ml 离心管	培养器皿	BD Biosciences	352096
50 ml 离心管	培养器皿	BD Biosciences	352070
精细弯镊	手术工具	Fine Science Tools	11251‐35
小型精细镊	手术工具	Fine Science Tools	11272‐30
小型镊子	手术工具	Fine Science Tools	11050‐10
精细剪刀	手术工具	World Precision Instruments, Inc.	500216
EGF	生长因子	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	生长因子	R&D Systems	3139-FB
肝素	生长因子	Sigma-Aldrich	H4784	用 PBS 重悬
*配制 HEM：取 1×10 L 的 MEM 粉剂包，加入 160 ml 1 M HEPES，用蒸馏水定容至 8.75 L，调节最终 pH 至 7.4，并于 4°C 保存。