来源：Eggers, C. H. 噬菌体介导的莱姆病螺旋体 Borrelia burgdorferi 遗传操作。 J. Vis. Exp. (2022)。
本视频演示了利用聚乙二醇介导的相分离技术，从 Borrelia burgdorferi 悬液中分离伯氏疏螺旋体噬菌体颗粒的方法。样品经离心后，使用盐溶液和分子拥挤剂处理以沉淀噬菌体。通过氯仿抽提去除杂质，并浓缩噬菌体颗粒。纯化后的噬菌体在低温条件下保存，以用于后续实验。
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从Borrelia burgdorferi中纯化噬菌体
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2026年7月31日
本文内容
摘要
方案
1. 聚乙二醇（PEG）沉淀法回收噬菌体
注意：本方案适用于噬菌体产生菌株（供体）对某种抗生素具有抗性，而待转导菌株（受体）不具有抗生素抗性或对另一种抗生素具有抗性的场景。
- 在感染噬菌体的 B. burgdorferi 培养物中加入适当抗生素，抗生素浓度参照表1所示。将样品在33 °C下孵育72–96小时。
- 准备用于聚乙二醇（PEG）沉淀的溶液。
- 配制500 mL的5 M氯化钠（NaCl）溶液。通过高压灭菌进行灭菌，并在使用前冷却。室温保存。
- 通过将200 g PEG8000溶解于400 mL水中配制500 mL的40% PEG溶液；边搅拌边轻微加热至完全混匀。再加水定容至500 mL。为彻底溶解PEG8000并灭菌，需将溶液高压灭菌并在使用前冷却。室温保存。
- 配制100 mL悬浮介质（SM；100 mM NaCl、10 mM硫酸镁（MgSO4）和50 mM三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）[pH 7.5]）。通过高压灭菌进行灭菌。4 °C保存。
- 对于来自供体 B. burgdorferi 克隆的噬菌体进行PEG沉淀时，在与噬菌体共同孵育72–96小时后，于4 °C下以8,000 × g离心20分钟。
- 将上清液倾入洁净的50 mL锥形管中；弃去细胞沉淀。加入5 M NaCl，使终浓度达到1 M。充分混匀。室温下轻柔摇动1小时。
- 于4 °C下以8,000 × g离心10分钟。将上清液倾入洁净的50 mL锥形管中；沉淀可能较小或不可见。向上清液中加入40% PEG8000溶液，使终浓度为10%。充分混匀后置于冰上超过1小时，可长达过夜。
注意：更长的沉淀时间似乎并未显著提高噬菌体回收率。 - 于4 °C下以8,000 × g离心20分钟。弃去上清液，并尽可能去除多余液体，但不得丢失含有噬菌体颗粒的沉淀。
- 用最小体积的SM重悬沉淀，使用SM冲洗管壁以收集可能存在的噬菌体颗粒。推荐比例为每10 mL原始上清液使用400 µL SM，但根据沉淀大小，可能需要更多或更少的SM以实现完全重悬。
- 根据重悬体积，用等体积的氯仿处理回收的噬菌体样品。充分混匀后于8,000 × g离心10分钟。小心移取水相（上层）至洁净离心管中，避免接触厚实的界面层。
注意：φBB-1是一种无包膜的噬菌体，对氯仿处理不敏感。此步骤旨在进一步破坏任何膜结合结构（如细胞或膜泡），并杀死潜在的细胞污染物。氯仿为挥发性有机溶剂，仅可在通风良好的通风橱中使用；含氯仿的废弃物应作为有机废物处理。 - 测定第一次氯仿处理后的回收体积，并加入相当于该体积10%的氯仿再次处理样品。充分混匀后于8,000 × g离心10分钟。小心移取水相（上层），避免接触界面层或有机相。将水相转移至洁净离心管中。
- 立即使用噬菌体或于4 °C保存。
注意：不建议冷冻保存φBB-1噬菌体样品。尽管φBB-1在4 °C下的稳定性尚未经过系统研究，但回收后于4 °C保存长达一个月的样品在转导实验中仍可成功使用。
| 抗生素 | 储存浓度 | 培养物中的终浓度 Bb |
| 卡那霉素 | 100 mg/mL-1 （在水中） | 200-400 μg·mL⁻¹-1 |
| 庆大霉素 | 50 mg/mL-1 （在水中） | 50 μg/mL-1 |
| 链霉素 | 50 mg/mL-1 （在水中） | 50 μg/mL-1 |
| 红霉素 | 2 mg/mL-1 （在乙醇中） | 0.06 μg/mL-1 |
表1：用于在B. burgdorferi中筛选和维持异源DNA的潜在抗生素及其使用浓度。 本列表基于目前在伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）中常用的抗生素抗性标记。卡那霉素、庆大霉素和链霉素用水配制，经0.22 µm滤膜过滤除菌后，于−20 °C保存。红霉素用95%乙醇配制，于−20 °C保存。许多实验室报道，在筛选时使用200 µg·mL−1的卡那霉素可获得成功；在转导实验中同时使用庆大霉素和卡那霉素进行筛选时，卡那霉素浓度为400 µg·mL−1。aadA基因可赋予对链霉素和壮观霉素的双重抗性。在E. coli中筛选含有aadA基因的构建体时，使用100 µg·mL−1的壮观霉素。需要注意的是，氨基糖苷类抗生素（卡那霉素、庆大霉素和链霉素）在莱姆病的临床治疗中并无应用价值；而红霉素在某些临床情况下则被使用。尽管已有报道指出伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi）对红霉素存在天然抗性，但截至目前，在本研究报道的转导实验中尚未使用该抗生素抗性标记。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 圆锥形离心管（聚丙烯） | USA Scientific | 5618-8271 | |
| 50 mL 圆锥形离心管（聚丙烯） | USA Scientific | 1500-1211 | |
| 无水乙醇 | |||
| 氯仿（分子生物学用） | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | 注意：易挥发有机物；仅可在化学通风橱中使用 |
| 聚乙二醇 8000（PEG） | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
| 氯化钠 | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| 二水合柠檬酸三钠 | Millipore Sigma | S1804-500G | 用于 BSK 的柠檬酸钠 |
