利用转轮跑动活动测量小鼠的昼夜节律和急性光反应

摘要

本文将综述可用于评估小鼠昼夜节律功能及光反应性的方法。

摘要

昼夜节律是指周期约为24小时的生理功能（circadian——circa意为“大约”，diem意为“日”）^{1, 2}。它们负责调控我们的睡眠/觉醒周期和激素分泌。由于该周期并不精确等于24小时，因此需要通过光信号输入与太阳日同步。这一过程通过视网膜向视交叉上核（SCN）传递光信号来实现，SCN作为主起搏器，协调大脑其他区域及外周组织中的外周生物钟与环境的光暗周期同步^3-7。节律与环境光暗周期的同步使特定的生理事件被安排在合适的时间区间，这对生存至关重要⁸。例如，小鼠在白天睡眠，夜间活动。这种将活动集中于光照期或黑暗期的能力被称为昼夜节律的光同步化（circadian photoentrainment），其依赖于光信号向生物钟的输入⁹。小鼠在夜间的活动尤为显著，尤其在存在跑轮的情况下。测量这种行为是一种微创性方法，可用于评估昼夜节律系统的功能以及光信号对该系统的输入情况。本文将介绍用于研究昼夜节律钟、光信号输入至该系统的过程，以及光对跑轮运动行为直接作用的方法。

方案

1. 仪器设置

1. 在设置任何行为学实验时，动物分组的准备至关重要。对于转轮活动实验，所有小鼠均需为雄性，年龄匹配，并尽可能来自同胞交配的后代。理想情况下，应使用约3个月大的年轻小鼠进行转轮活动实验。
2. 在将动物放置到转轮装置前，需要先完成整个房间的布置。这包括为每个笼子配备1个转轮、1个转轮转数探测器、笼底铺少量小鼠垫料，以及提供足够两周使用的充足食物和饮水。
3. 房间光照条件极为重要。在设置转轮活动笼时，必须测量每个笼子处的光照强度，以确保各笼之间的光照均匀一致。此外，在选择光源时，应选用光谱范围较广、覆盖450 nm–650 nm的光源。许多厂商提供的“日光”或“全光谱”荧光灯管即符合这一要求。（见图1）

2. 实验设置

1. 将小鼠引入转轮活动笼时，应使其光照周期与此前饲养环境中的光/暗周期尽可能一致。
2. 尽量均匀分布小鼠，以确保各组环境条件相似。例如，避免将同一组小鼠全部集中放置于某一特定区域（如单个架子上），以免无意中引入额外变量。
3. 在实施任何光照周期干扰或开始记录活动之前，应给予小鼠约一周时间以适应新笼具和转轮。若小鼠在一周后仍未在转轮上活动，应将其移出笼具并更换为其他小鼠。
4. 当动物群体在转轮上的活动趋于稳定后，即可开始设置不同的光/暗周期以检验各种假设。各类光照周期的具体设置将在第3部分中详细讨论。

3. 实验检测

1. 为了检测光同步能力，首先将小鼠饲养在12小时光照：12小时黑暗的循环环境中。例如，光照开启时间为早上7:00至晚上7:00，光照关闭时间为晚上7:00至次日早上7:00。此外，降低光照周期中12小时光照部分的光照强度，有助于揭示小鼠在光同步过程中对光敏感性的差异。在改变光照强度之前，应给予小鼠两周时间完成光同步。（图2）
2. 光同步的另一个方面是重新调整或再同步昼夜节律以适应新的光/暗周期的能力。这可以通过提前小鼠所处的光/暗周期来实现，即让光照提前开启和关闭。通常将光周期提前6小时；例如，原本的光照周期为早上7:00至晚上7:00，则调整为凌晨1:00至下午1:00。也可以通过延迟光周期来检测这一能力。小鼠通常可在5至7天内完成再同步。（图3）
3. 然而，这些实验范式并不能完全评估内源性昼夜节律钟的功能。将小鼠置于持续黑暗条件下，可用于测量其内源性昼夜节律周期，也称为自由运行周期。在野生型小鼠等夜行性动物中，内源性周期短于24小时，这意味着它们每天开始在转轮上活动的时间会略微提前。（图2）该周期的具体时长在不同小鼠品系间略有差异。例如，C57小鼠的自由运行周期约为23.3小时，而BALB/cJ小鼠则为22.5小时¹⁰。
4. 在确定了持续黑暗条件下的自由运行周期后，可通过相位偏移来检测光输入对昼夜节律系统的影响。相位偏移是指一次短暂的光脉冲对昼夜节律钟产生的偏移作用。可通过在持续黑暗条件下饲养的小鼠活跃期给予一次短暂的光脉冲（15分钟；1000 lux），并测量此后数天活动起始时间的变化来实现相位偏移检测。（图4）先前的研究已绘制出描述光刺激时间与偏移方向及幅度关系的响应曲线（称为相位响应曲线）^{11, 12}。例如，在活动开始后4小时（CT16）给予一次15分钟、1000 lux的光脉冲，会导致活动延迟2小时；而在活动开始后8小时（CT20）给予相同的光脉冲，则会导致活动提前2小时。（图4）
5. 为了测试光对转轮活动的直接作用，可在黑暗/活跃期向小鼠施加一次光脉冲。此时光照的存在会抑制转轮活动。尽管光脉冲的持续时间可以变化，但我们发现，在黑暗期开始2小时后施加一次持续3小时的光脉冲最具信息价值。（图5）在某些情况下，可在测试前通过调整光周期使活动行为集中化，例如在施加光脉冲前一周将光周期调整为16小时光照：8小时黑暗周期。
6. 通过使用超昼夜（T7）光周期¹³，可在昼夜节律周期的所有时相检测光对转轮活动的直接抑制作用。该周期由3.5小时光照与3.5小时黑暗交替组成，持续一周¹³。由于小鼠无法在此条件下实现光同步，因此在为期一周的处理过程中，光脉冲可覆盖昼夜节律周期的各个时相。（图6）
7. 与持续黑暗条件类似，将小鼠饲养在持续光照条件下也会表现出特征性的自由运行周期。然而，该周期将长于持续黑暗条件下的周期。持续光照下的自由运行周期长度与光照强度呈正相关¹⁴；即光照强度越高，自由运行周期越长。（图7）然而，小鼠极少表现出超过26小时的周期。相反，在强光条件下，其活动会变得无节律。因此，若计划比较持续光照下的周期长度，光照强度是一个需要重点考虑的因素。
8. 在决定这些光干扰处理的顺序时，需注意先前的光周期可能会影响昼夜节律。因此，建议首先进行最温和的处理，并逐步过渡到更强烈的光处理。例如，光同步检测、持续黑暗和相位偏移均属于较温和的处理方式，似乎不会产生长期影响。而T7周期和持续光照则属于强烈的光处理，可能导致节律紊乱，应保留在实验末期进行。

4. 分析数据

1. 采集跑轮活动数据，并将给定时间区间内的跑轮转数进行分段归类。该分段时间（即采样间隔）通常为10分钟。数据可在Excel电子表格中显示，展示每个时间段内的跑轮转数。这有助于量化和比较跑轮转数。数据也可显示为活动图谱（actogram），其中每个时间段的活动量以黑色条形的高度表示，类似于直方图。（图2）
2. 活动起始时间定义为主导活动时段的开始。每个个体的具体参数可能有所不同，但通常我们寻找持续时间超过30分钟的首次活动时段。
3. 为分析小鼠光同步能力，可考察多个指标。判断小鼠是否实现光同步的常用标准包括：其活动起始时间与光照结束时间之间存在稳定关系，且大部分活动集中在黑暗期。
4. 在研究小鼠重新同步至提前的光/暗周期时，活动起始时间提供的信息最为重要；而在研究其重新同步至延迟的光/暗周期时，活动结束时间则更具参考价值。小鼠通常需要5至7天才能完全将其跑轮活动重新同步至提前或延迟6小时的光/暗周期。判断小鼠是否完成重新同步，特别是对光周期提前的响应，应观察其活动起始时间与光照结束时间之间是否建立稳定关系。该关系应与光周期调整前观察到的情况相似，并持续至少三天。（图3）
5. 为计算恒定黑暗和恒定光照条件下的周期，需确定连续两周的活动起始时间，并拟合回归直线。如前所述，在野生型小鼠中，恒定黑暗条件下的周期短于24小时，而恒定光照条件下的周期则长于24小时。（图2和图7）
6. 计算光脉冲后的相位偏移时，首先需对光脉冲前至少5天和光脉冲后至少5天的活动起始时间拟合回归直线。通过计算这两条回归直线之间的差异，确定相位偏移的幅度。（图4）

5. 代表性结果

观察转轮跑动记录时，应看到每只小鼠持续跑动数小时。由于小鼠为夜行性动物，在明暗周期条件下，这种跑动或活跃期会与黑暗期相对应。在恒定条件下自由运行的小鼠，也会出现这一局限性的持续活动期，代表其自由运行节律的活跃相。在持续黑暗中，该周期短于24小时；而在持续光照中，则长于24小时。在活动开始后4小时（CT16）给予一次15分钟、1000勒克斯的光脉冲，将导致此后数天活动 onset 的延迟。

图 1：典型光源光谱。 A. 太阳光产生的光谱在400 nm至700 nm范围内较宽且相对均匀，该范围对应于可见光谱部分。B. 白炽灯的光谱在红外区域达到峰值，导致其偏红，而在蓝光区域强度较低。C. 典型的荧光灯具有离散的光谱峰，人眼观察时呈现“白色”。D. 然而，日光型荧光灯具有更高的宽带光谱和离散频率峰，结果是一种不如白炽灯发热但光谱比普通荧光灯更宽的光源。

图 2：昼夜节律的光同步化。该活动图记录了单只小鼠的活动情况，其中连续的天数沿 y 轴排列，时间沿 x 轴排列。黑色条代表转轮转动的次数，背景阴影用于指示明暗周期。在第 1 至第 8 天，小鼠处于 12 小时光照：12 小时黑暗的周期环境中。在此期间，小鼠在光照结束时开始奔跑，并将活动集中于黑暗期。在光照期，活动量极低。在第 9 天，光照被关闭，使小鼠处于持续黑暗环境中。由于缺乏光周期信号，昼夜节律钟失去外界输入，因而按照其内在节律运行。如图所示，每天的活动开始时间逐渐提前，表明该动物的内在节律短于 24 小时。

图3：再同步。再同步范式包括将光周期向前或向后移动，迫使昼夜节律时钟适应新的光周期。在此示例中，光周期在第9天提前6小时，然后在第20天延迟6小时。在这两种情况下，均需要数天时间才能完成完全的再同步，但根据移动方向的不同，对节律起始时间或终止时间的影响更为显著。

图 4：短时间光脉冲引起昼夜节律的相位偏移。A. 动物在持续黑暗环境中自由运行，其周期短于24小时。在第8天，于活动开始后4小时（CT16）给予一次持续15分钟、照度为1000勒克斯的光脉冲。在随后的几天中，可观察到活动起始时间发生偏移。相位偏移是指根据光脉冲前动物活动规律预测的活动起始时间与光脉冲后实际开始活动时间之间的差异。
B. 小鼠的相位响应曲线显示了在特定昼夜节律时间给予短暂光脉冲所引发的相位偏移程度和方向。在主观白天（CT0-12）给予光脉冲不会引起显著的相位偏移，该时段被称为“无效区”。从CT12至CT19期间，光脉冲可引起相位延迟，其中在CT16给予光脉冲时延迟达到峰值。在CT19至CT24之间，光脉冲会引起活动节律的相位提前，其中在CT20给予光脉冲时提前达到峰值。

图 5：夜间光脉冲可抑制或掩盖轮转活动。本示例中，光照周期为16小时光照：8小时黑暗，活动时间集中。在第4天光照关闭后2小时开始一个持续3小时的光脉冲。在此期间，轮转活动极少或完全停止，表明光可直接抑制活动行为。光脉冲结束后，活动恢复。

图6：采用T7光照周期使小鼠在整个昼夜节律周期中接受光脉冲刺激。T7周期由3.5小时光照和3.5小时黑暗交替组成。在此周期中，小鼠仍可维持昼夜节律，但在光照期间会出现轮跑活动的掩蔽效应。通过比较光照期间与黑暗期间的活动量，可量化不受昼夜节律时间偏倚影响的掩蔽效应。

图7：恒定光照下节律周期延长。第1-8天显示小鼠的光同步化现象，类似于图2；然而从第9天起，小鼠被置于恒定光照环境中。在此条件下，小鼠表现出自由运行的节律，其周期长于24小时，表现为每日活动起始时间逐日推迟。

讨论

昼夜节律在历史上已被多种生物中测量和记录。尽管我们已具体描述了记录小鼠活动节律的方法，但该技术可轻松修改后用于测量其他啮齿类动物（如仓鼠和大鼠）的节律，这些动物在昼夜节律研究中也常被使用。然而，不同生物的自由运行周期以及重新同步所需的时间会有所不同。例如，仓鼠在持续黑暗条件下的自由运行周期为24.0小时，而小鼠则短于24小时。如果所研究的生物不适合通过转轮活动来测量节律，则可采用许多相似的光照范式，但应观察其他不同的生理节律。最相近的测量指标是总体活动水平。在人类、猴子和狗中，研究人员常使用活动记录仪（actigraphy）来测量个体的运动量。在人类中，体温和褪黑素分泌也常被测量，二者均已被证实具有昼夜节律，并能够发生相位偏移和重新同步^{15, 16}。

尽管我们将这些生理节律视为离散的事件，但实际上它们之间存在密切关联。动物的活动节律通常与体温节律高度重叠，且与睡眠节律呈相反关系。此外，常被用作昼夜节律相位标志物的褪黑素分泌节律，在人类中与正常的睡眠节律非常相似。由于这些节律相互交织，对其中一个节律的研究可以为其他节律的结果提供信息并进行预测。例如，N...

材料

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姓名	公司	目录编号	评论
11.5 cm 跑轮	Mini Mitter
数据采集用 Vital View 软件	Mini Mitter
数据分析用 Clock Lab 软件	Actimetrics