通过microRNA模拟物介导的基因组沉默评估病毒传播抑制

摘要

来源：Ruiz, A. J. 和 Russell, S. J. 基于microRNA的肠道病毒趋向性调控。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了使用合成 microRNA 模拟物选择性抑制培养的类上皮细胞中病毒复制的方法。重点介绍了通过 microRNA 指导的基因组沉默来阻断病毒传播，并通过下游感染性分析验证靶向特异性的过程。

方案

1. 评估 microRNA 靶向特异性：利用合成 microRNA 模拟物的病毒扩散实验

注意：使用合成的 microRNA 模拟物以验证 microRNA 与 microRNA 靶标相互作用的特异性。

1. 每次实验均需设置空白转染、阴性对照microRNA模拟物以及仅含实验用microRNA模拟物的对照组，以评估microRNA介导的细胞毒性。同时建议设置阳性对照（即microRNA靶向的基因或基因组），因为microRNA模拟物转染效率较低可能导致假阴性结果。
2. 将H1-HeLa细胞接种于96孔组织培养板中，使细胞在转染时达到80–90%汇合度（接种后24小时）。每孔加入0.1 mL含10%胎牛血清的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）。
   注意：本实验应在允许病毒复制但不表达相应microRNA的细胞中进行。
3. 将转染试剂恢复至室温。每孔加入9 µL无血清培养基、终浓度为200 nM的microRNA模拟物原液、0.18 µL增强试剂和0.18 µL转染试剂，混匀。室温孵育2–5分钟。
   注意：所列体积均为每孔用量。建议配制总体积的混合液（主混合液），用于所有孔的转染，以保证一致性并减少移液误差。microRNA模拟物的最佳浓度可能有所不同，请参考产品说明书推荐的起始浓度，通常终浓度范围为5–200 nM。
4. 吸除各孔中的培养基，每孔加入92 µL新鲜完全培养基。
   注意：若样本数量较多，可在配制转染溶液前完成此步骤，并将培养板置于37 °C孵育直至使用。
5. 将全部转染混合液逐滴加入细胞中。
6. 在37 °C孵育6小时。
7. 以较低感染复数（MOI）感染各孔，以确保仅有少量细胞被感染，从而便于分析病毒扩散情况。本方案采用MOI为0.2。
   1. 用无血清培养基将病毒原液稀释至每100 µL含MOI = 0.2的病毒量。吸除孔内培养基，每孔加入100 µL病毒稀释液。
   2. 在37 °C孵育2小时。
8. 吸除各孔培养基，每孔加入100 µL新鲜完全培养基。
9. 在37 °C孵育20–22小时。
10. 测定上清液中的病毒滴度。
    1. 收集各孔上清液，并每孔补充100 µL新鲜完全培养基。
       注意： 若使用悬浮细胞，需将后续步骤中获得的细胞沉淀用100 µL新鲜完全培养基重悬后，放回原样本孔中进行活力检测。
    2. 在4 °C条件下，以300 × g离心5分钟，去除收集的上清液中的细胞碎片。
    3. 将澄清后的上清液转移至新管中，在不表达相应microRNA的易感细胞上测定感染性病毒滴度。 
       注意： 所有样品应置于冰上保存，以防感染性丧失。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无核酸酶水	Fisher Scientific	AM9938
TransIT-2020 转染试剂	Mirus	MIR 5404
TransIT-mRNA 转染试剂	Mirus	MIR 2225
2 mL 螺口管	Sarstedt	72.694.005
microRNA 模拟物	Dharmacon	Varied
MTT 细胞增殖检测	ATCC	30-1010K