治疗性病毒生产上皮细胞的制备与收获

摘要

来源：Heidbuechel, J. P., 等. 针对肿瘤的副黏病毒免疫调节：体外设计与评估。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了利用基因工程病毒感染肾上皮细胞，以进行病毒的生产与收获，从而研究病毒复制过程。

方案

1. 测定编码免疫调节因子的病毒载体的复制能力和细胞毒性

通过单步或多步生长曲线（GCs）比较所构建的重组病毒与未修饰载体的复制动力学。对于单步生长曲线，通过所有细胞同时感染（理论上为100%感染）后评估病毒子代。多步生长曲线则从较低比例的感染细胞开始，以追踪多轮病毒复制过程。

1. 为分析麻疹病毒的复制动力学，于感染前一天，在12孔板中每孔接种1 × 10⁵个Vero细胞，每孔加入1 mL含10% FBS（胎牛血清）的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）。每个关注的时间点至少设置两个孔作为技术重复。
2. 分别以低感染复数（MOI）进行多步生长曲线实验，或以高MOI进行单步生长曲线实验（针对Vero细胞上的MV或麻疹病毒复制，MOI分别为0.03和3）。弃去原培养基，更换为含有相应病毒量的300 µL无血清培养基，在37 °C、5% CO₂条件下孵育至少2小时。移除接种病毒液，加入1 mL含10% FBS的DMEM，继续孵育。
3. 在感染后12、24、36、48、72和96小时等相应时间点，通过直接将细胞刮入培养基中收集病毒子代。将每孔内容物转移至独立离心管中，液氮速冻后于-80 °C保存，直至进行滴度测定。
   注意：此步骤中可将重复样本合并，用于平均滴度的分析。
4. 收集所有时间点的样本，在37 °C同时解冻以测定病毒子代。涡旋混匀后，在2,500 × g、4 °C条件下离心5分钟，沉淀细胞碎片。
5. 按上述方法计算每种构建体在各时间点的平均滴度。绘制滴度随时间变化的曲线。比较插入与未插入外源基因的载体、携带不同外源基因的载体，或外源基因插入位置不同的载体之间的生长曲线（见图1）。

结果

图1：重组麻疹病毒的复制动力学与裂解活性。 （A）在感染未修饰的溶瘤性麻疹病毒（MV）或编码双特异性T细胞衔接蛋白的麻疹病毒（MV-H-mCD3xhCD20）后，以感染复数（MOI）为1的条件感染Vero细胞，绘制单步生长曲线。在指定时间点检测病毒子代滴度，结果显示病毒复制动力学相似。数据展示八个样本的均值及标准差（每个时间点包含两个生物学重复，每个生物学重复设四个技术重复）。 （B）仅加入培养基（模拟感染）或以MOI为1的条件接种指定病毒后，检测稳定表达人癌胚抗原及麻疹病毒受体CD46的MC38小鼠结肠直肠癌细胞（MC38-CEA-CD46）的细胞活力。在指定时间点进行XTT细胞活力检测。未修饰载体在较早时间点即观察到细胞活力下降。在感染后早期（如MV-H-mCD3xhCD20在12小时时间点）计算出超过100%的数值在实验中常有出现，可能与细胞应激或病毒悬液中存在的细胞来源因子有关。每个时间点的数据展示三个技术重复的均值加标准差。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）	Invitrogen, Darmstadt, Germany	31966-021	用于Vero细胞的接种和感染
胎牛血清（FBS）	Biosera, Boussens, France	FB-1280/500	用于DMEM的补充
Vero细胞	ATCC, Manassas, VA, USA	CCL81	麻疹病毒增殖与检测的宿主细胞
12孔板	Neolab, Heidelberg, Germany	353043	用于接种Vero细胞（每孔1 × 10⁵）
Opti-MEM（无血清培养基）	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany	31985070	用于病毒感染步骤（无血清孵育）
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany	14190-094	用于洗涤和培养基配制
细胞刮刀	Corning, Reynosa, Mexico	3008	用于收获时刮取感染细胞
50 mL离心管	nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany	02-572-3001	用于样品收集和离心
液氮	—	—	用于快速冷冻收获的病毒样品
离心机（可达到2,500 × g）	—	—	用于沉淀细胞碎片
XTT细胞活力检测试剂盒（比色法细胞活力检测试剂盒III）	PromoKine, Heidelberg, Germany	PK-CA20-300-1000	包含XTT试剂；用于细胞毒性测定
96孔平底板	Neolab, Heidelberg, Germany	353072	用于在450 nm处测定吸光度
分光光度计/酶标仪	—	—	用于测定450 nm处的光吸收值（参考波长630 nm）
二氧化碳培养箱	—	—	所有细胞孵育均在37 °C、5% CO₂条件下进行