病毒编码双特异性T细胞衔接分子免疫调节活性的评估

摘要

来源：Heidbuechel, J. P., 等. 用于肿瘤靶向免疫调节的副粘病毒：体外设计与评估。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种基于细胞的检测方法，用于评估病毒编码的双特异性T细胞衔接蛋白（BTE）针对特定靶标的免疫调节活性。该BTE可将表达特定靶标受体的肿瘤细胞与T细胞连接，从而触发肿瘤细胞裂解和酶的释放。通过底物转化产生的比色读数来指示T细胞的活化情况。检测样本中颜色越深，表明BTE介导的、受体特异性的免疫激活作用越强。

方案

1. 评估分离的免疫调节剂的免疫学功能。
   1. 以下详细描述如何通过乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估双特异性T细胞衔接分子（BTE）诱导的细胞介导的细胞毒性。
      1. 确定实验中需测试的条件（参见图1作为示例）。可变动的因素包括时间点（数小时至数天）、免疫调节剂的浓度（pg/mL至µg/mL）以及效应细胞与靶细胞（E:T）的比例（例如，1:50至50:1之间）。所有样本均应设置三个重复。
      2. 设置不含BTE蛋白和不含效应细胞的样本，包括单种细胞类型的自发LDH释放对照（Tsp和Esp）、在检测前加入去垢剂的靶细胞最大裂解对照（Tmax）、仅含培养基的对照，以及Tmax的体积对照。
         注意：所需靶细胞数量和孵育时间可能有所不同。在不含效应细胞和免疫调节剂的条件下进行初步测试，以确定最佳参数。包含Tsp和Tmax样本及其相应对照，用于评估不同细胞数量和时间点。
      3. 分离免疫效应细胞（例如，通过密度梯度离心法从人血中获取外周血单个核细胞（PBMCs），或从鼠脾细胞中通过阴性筛选法分离小鼠T细胞）。
      4. 将靶细胞接种至U型底96孔板中（例如，每孔5 × 10³个细胞）。
      5. 向各相应样本中加入所需浓度的分离蛋白。按所需比例加入免疫效应细胞。加入培养基，使每孔总体积达到100 µL。
      6. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育预定时间，通常为4至48小时（未刺激的PBMCs为24小时，新分离的小鼠T细胞为48小时；预刺激的免疫细胞可采用较短的孵育时间）。
      7. 在收集样本前45分钟，向含有Tmax样本及相应培养基对照的孔中加入10 µL 10倍浓缩的裂解液。继续孵育。
      8. 以250 × g离心4分钟，沉淀细胞。将每孔上清液50 µL转移至平底96孔板中。避免转移细胞，以防细胞结合的LDH被带入。
      9. 根据试剂盒说明书配制底物溶液。每孔加入50 µL，室温[RT]避光孵育30分钟，或直至Tmax样本变为深红色。
      10. 每孔加入50 µL终止液。以4,000 × g离心1分钟去除气泡，并用空心针手动去除残留气泡。在490 nm波长下测定光吸收值。
      11. 计算每个样本的特异性裂解百分比（% specific lysis）值。
          1. 计算含与不含裂解液的培养基对照重复孔的平均值。将所得数值分别从实验样本、Tmax及自发释放对照中减去。使用这些经背景校正后的数值进行后续计算。
          2. 计算经背景校正后的Tmax、Tsp和Esp对照的平均值。利用这些平均值，以下公式可得出每个样本的特异性裂解百分比：
             
          3. 绘制特异性裂解百分比值与蛋白浓度或E:T比例的关系图，并与非靶向对照样本进行比较。

结果

图1：麻疹病毒编码的双特异性T细胞衔接蛋白（BTE）的细胞毒活性。 将靶向肿瘤细胞（每孔5 × 10³个B16-CD20-CD46细胞）与小鼠T细胞以1:50的比例共孵育。将先前从感染MV（麻疹病毒）-H-mCD3xhCD20细胞的上清液中纯化的BTE（双特异性T细胞衔接蛋白）以指定浓度加入。孵育48小时后，通过乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估靶细胞的相对裂解程度。不表达BTE靶抗原的细胞（B16-CD46）作为参照，用于评估抗原特异性的细胞毒性。数据展示每样本三个技术重复的均值加标准差。表达靶抗原的细胞以BTE浓度依赖的方式被特异性裂解。BTE产物的纯度和靶抗原的表达水平会影响细胞杀伤效果。在本示例中，在相对较高的BTE浓度（1 µg/mL）下实现了15%的特异性细胞杀伤。这在具有较长共孵育时间及次优T细胞培养条件的实验设置中属于典型值。在其他实验条件下，使用从MV感染上清液中纯化的BTE可实现高达60%的特异性杀伤，在BTE浓度达到100 ng/mL及以上时达到平台期。这表明，与直觉相反，该实验的检测上限通常低于100%的特异性杀伤，其原因可归结为Tmax对照组与共培养样本之间存在不同的生长动力学差异。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）	Invitrogen, Darmstadt, Germany	31966-021
胎牛血清（FBS）	Biosera, Boussens, France	FB-1280/500
卡那霉素	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	K0129
B16-CD46 / B16-CD20-CD46	J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg		可根据要求提供
比色法细胞活力检测试剂盒 III（XTT）	PromoKine, Heidelberg, Germany	PK-CA20-300-1000	包含 XTT 试剂
磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany	14190-094
QIAquick Ni-NTA 离心柱	QIAGEN, Hilden, Germany	31014
96 孔圆底板	TPP, Trasadingen, Switzerland	92097
96 孔平底板	Neolab, Heidelberg, Germany	353072