利用表达内源性野生型 BRCA1 的细胞鉴定 BRCA1 突变对同源重组的影响

摘要

我们提供一种方法，通过RNA干扰技术耗尽细胞内源性的BRCA1蛋白，并用含有编码改变的BRCA1点突变体进行替代，在基于组织培养的体系中检测BRCA1变异体在DNA损伤同源重组修复中的功能。

摘要

错义突变的功能分析可能因细胞内存在内源性蛋白而变得复杂。BRCA1的结构-功能分析一直受到缺乏针对全长BRCA1蛋白的可靠检测方法以及使用表达功能低下型BRCA1蛋白的细胞系所固有困难的限制^1,2,3,4,5。我们建立了一个系统，通过RNAi靶向BRCA1 mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR），在细胞中急性耗竭内源性BRCA1蛋白，并通过共转染表达BRCA1变异体的质粒进行替代。该方法的一个优势在于，BRCA1的急性沉默与同时替代可使细胞在无需因长期缺失BRCA1功能而产生二次突变或适应性改变的情况下正常生长。该耗竭-回补实验在一种易于检测同源重组活性的HeLa来源细胞系中完成。同源重组检测基于先前发表的方法，即将一个重组底物整合入基因组（图1）^6,7,8,9。该重组底物在一个无活性的GFP等位基因内部含有罕见切割的I-SceI限制性内切酶识别位点，其下游还有一个无活性的GFP等位基因。转染表达I-SceI的质粒后，会引发双链断裂，该断裂可通过同源重组方式进行修复；若同源重组成功修复断裂，则会形成一个有活性的GFP等位基因，可通过流式细胞术检测GFP蛋白的表达水平进行定量分析。耗竭内源性BRCA1导致同源重组活性下降8至10倍，而回补野生型质粒则完全恢复了同源重组功能。当从共转染的质粒中表达特定的全长BRCA1点突变体时，即可评估特定错义突变体的功能效应。例如，表达BRCA1(M18T)蛋白（一种临床意义未明的变异体）¹⁰时，其无法恢复BRCA1依赖的同源重组功能；相比之下，另一种同样临床意义未明的变异体BRCA1(I21V)的表达则完全恢复了BRCA1依赖的同源重组功能。这种检测BRCA1错义突变功能的策略已被应用于另一个检测中心体功能的生物系统中（Kais等，未发表观察结果）。总体而言，该方法适用于对任何需以隐性方式分析的基因的错义突变体进行功能分析。

方案

1. 含整合重组底物的细胞系

1. HeLa 细胞通过 pDR-GFP 质粒（该质粒由纪念斯隆-凯特琳癌症中心 M. Jasin 惠赠⁷）进行稳定转染，并在嘌呤霉素中培养以筛选转化子。
2. 细胞在含有 10% 胎牛血清、2 mM GlutaMAX、1 mM 丙酮酸钠、青霉素/链霉素（100 U/mL/0.1 mg/mL）和 1.5 µg/mL 嘌呤霉素的 DMEM/FBS 培养基中传代培养。

pDR-GFP 质粒及稳定转化子中的重组底物包含两个失活的 GFP 等位基因（图1）。其中一个等位基因因其编码序列中插入了18 bp的I-SceI限制性内切酶识别位点而失活。在这些细胞中表达I-SceI会引发双链DNA断裂（DSB）。该DNA上还存在第二个失活的GFP等位基因，但其序列中与第一个等位基因上的I-SceI位点相对应的区域为野生型。该第二个GFP等位基因可作为同源重组修复DSB的序列供体，从而产生有活性的GFP等位基因，可通过流式细胞术轻松检测。或者，DSB也可能通过非同源末端连接方式进行修复，这将破坏I-SceI限制性位点，并导致产生GFP阴性细胞。细胞中同源重组的水平通过统计GFP阳性细胞所占的百分比来确定。

在所有克隆中，pHeLa-DR13-9细胞系因其在转染表达I-SceI的质粒pCBASce后无背景GFP信号且GFP阳性细胞比例相对较高而被选中。（pCBASce及其空载体对照pCAGGS均由纪念斯隆-凯特琳癌症中心的M. Jasin提供。）
HeLa-DR13-9细胞系可应要求向作者索取。

2. 转染以耗尽内源性 BRCA1 并回补突变型 BRCA1。

1. 第一次转染的前一天（通常为星期二）：准备一个直径10 cm的培养皿，其中HeLa-DR13-9细胞汇合度至少达到90%。
2. 用1 mL胰蛋白酶消化，加入9 mL DMEM/FBS终止反应，并用移液器充分混匀。
3. 将胰蛋白酶消化后的细胞每孔40 μL加入含0.5 mL DME/FBS的24孔板中。
4. 第1天转染（星期三）：细胞汇合度应约为40–50%，若明显低于此范围则需重新开始。转染操作如下：将5 pmol siRNA与0.3 μg表达BRCA1突变体的质粒DNA混合于12.5 μL Opti-MEM中；另将0.5 μL Lipofectamine 2000溶于12.5 μL Opti-MEM中。随后按照Lipofectamine试剂说明书（Invitrogen）进行转染。
5. 转染后4–6小时更换培养基。我们用于敲低BRCA1的siRNA序列基于GCUCCUCUCACUCUUCAGU，靶向BRCA1 3'-UTR区序列第80,780至80,798位（登录号AY273801）。
6. 第2天：将细胞从24孔板经胰蛋白酶消化后转移至6孔板中。
7. 第3天转染：将25 pmol siRNA、0.75 μg表达BRCA1突变体的质粒DNA以及0.75 μg pCBASce（或pCAGGS空载体对照）溶于62.5 μL Opti-MEM中，另将2.5 μL Lipofectamine 2000溶于62.5 μL Opti-MEM中。转染后4–6小时更换培养基。

3. 转染细胞的分析。

1. 第6天时，用胰蛋白酶消化各孔中的细胞，并用1 mL DMEM/FBS终止消化。可于第5天或第7天检测细胞的GFP表达，但我们发现第6天效果最佳。
2. 通过流式细胞术分析每孔10,000个细胞。我们使用俄亥俄州立大学综合癌症中心分析细胞学共享资源平台的Becton Dickinson FACSCalibur仪器。利用前向散射和侧向散射参数圈选单个活细胞。通过GFP荧光检测器（FL1）检测GFP阳性细胞，结果以直方图形式展示（图2，底部）。
3. 如有需要，剩余细胞可重新接种用于荧光显微镜拍照。

4. 代表性结果：

BRCA1 调控通过同源重组修复双链 DNA 断裂的通路^6,11。通过荧光显微镜可轻松检测到经同源重组修复的细胞（图2，上方）。BRCA1 缺失会导致检测到的 GFP 阳性细胞数量减少（图2，右侧）。FACSCalibur 的输出结果为直方图，其 X 轴表示每个细胞的 GFP 荧光强度，Y 轴表示细胞数量（图2，下方）。在单次实验的典型结果中，I-SceI 表达并进行对照 RNA 干扰后，有 15.5% 的细胞呈 GFP 阳性（图3）。相比之下，BRCA1 缺失并回补空载体后，GFP 转化率降至 0.7%。回补野生型 BRCA1 或 BRCA1(I21V) 均可完全恢复同源重组活性，表现为 GFP 阳性细胞比例恢复至 15–16%。而回补 BRCA1(M18T) 突变体（图3，第5泳道）的效果与回补空载体对照相似。由于该变异体的表达水平与内源性蛋白相当⁹，因此我们认为 BRCA1(M18T) 变异体在同源重组中无功能。

转染 I-SceI 表达质粒后，通常有 10-20% 的细胞转化为 GFP 阳性细胞。BRCA1 耗竭可重复地使 GFP 阳性细胞的转化率降低约 8-10 倍。尽管不同实验之间 GFP 阳性细胞的实际百分比可能有所变化，但在同一实验中，BRCA1 耗竭组相对于对照组的 GFP 阳性细胞比例相当稳定。我们通过将未抑制条件下的转化率标准化为 100%，并将 BRCA1 耗竭及回补实验的结果以百分比形式表示。通过这种方式，可以整合多个实验的数据，且实验间的变异程度较低。

迄今为止，BRCA1 突变体的回补实验已获得可靠结果：每个 BRCA1 变体要么完全恢复同源重组活性，要么完全无影响。获得这些结果的一个重要考虑因素是，我们的转染条件所产生的 BRCA1 蛋白水平，大致等于未经处理细胞中内源性蛋白的浓度。即使是有缺陷的 BRCA1 突变体，过表达过高也可能导致一定程度的阳性同源重组活性。

我们需要克服的一个问题是转染的毒性。BRCA1 本身的耗竭会减缓细胞生长，因此必须保持培养皿中细胞数量与 Lipofectamine-2000 及质粒 DNA 用量之间的平衡。Lipofectamine 或质粒 DNA 用量过多会减少细胞数量，导致细胞数量不足以获得可靠的流式细胞术结果。质粒和 Lipofectamine 试剂与转染细胞数量之间的平衡对于维持细胞活力至关重要。

图1. 重组底物。图示为M. Jasin研究团队所开发的策略^7,12。pDR-GFP质粒包含两个有缺陷的GFP等位基因，其中一个含有I-SceI限制性内切酶位点。一种HeLa来源的细胞系将该DNA底物整合于基因组中的单一位置⁹，通过同源重组修复I-SceI位点处的双链DNA断裂，可使其中一个等位基因转变为GFP阳性。

图 2. 通过荧光显微镜检测 GFP 阳性细胞。按照本实验方案进行检测，对照组基因沉默的细胞在同源重组中具有活性，表现为高比例的 GFP 表达细胞（左图）。通过 RNAi 沉默 BRCA1 后，GFP 阳性细胞数量显著减少（右图）。

图3. BRCA1错义突变体回补实验的结果。本直方图显示单次实验的结果。在未转染表达I-SceI的质粒的情况下（第1泳道），未检测到GFP阳性细胞。第2至第6泳道的结果均来自在第3天转染了表达I-SceI质粒的细胞。在敲低无关基因（荧光素酶）并回补空载体的细胞中，15.5%的细胞为GFP阳性（第2泳道）。敲低BRCA1并回补空载体，显示出BRCA1缺失对同源重组的影响（第3泳道）。图中还展示了敲低BRCA1后回补野生型BRCA1（第4泳道）、BRCA1(M18T)（第5泳道）和BRCA1(I21V)（第6泳道）的效果。这些结果来自单次实验，需与至少另外两次重复实验的数据合并，以评估特定BRCA1突变体蛋白所支持的同源重组水平。

讨论

该方法的优势在于，我们可以利用内源性表达野生型BRCA1的细胞，研究BRCA1蛋白在同源重组介导的DNA修复中的功能。我们结合了两种已建立的实验方法：一种用于研究同源重组过程，另一种利用RNA干扰介导的基因敲降，由此建立了一种检测BRCA1变异体在DNA修复中功能的新方法。该方法成功的关键是构建一种易于转染的细胞系（例如HeLa细胞），并在其基因组中整合同源重组报告底物，从而实现高水平的GFP信号转换。我们对原始转化产生的多个克隆进行了筛选，最终获得了一个在未转染时无明显背景GFP信号、而在转染I-SceI表达质粒后能产生极高GFP转换效率的克隆。

利用该方法，我们目前正在研究其他特定的BRCA1氨基酸残基在同源重组中的功能。除了本研究所提供的生物学见解外，这些结论还可应用于临床肿瘤遗传学。大量BRCA1错义突变的临床意义尚不明确，因为存在许多罕见变异，且其中多数缺乏足够的信息，无法通过遗传分离分析确定其与癌症的关联性^3,10,13,14。利用该方法，可评估特定变异对BRCA1调控同源重组生物学功能的影响，从而为携带这些基因组变异的女性提供临床参考依据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Invitrogen	11960
FBS	USA Scientific, Inc.	9871-5200
siRNA	Invitrogen	N/A
Lipofectamine-2000	Invitrogen	11668
TrypLE	Invitrogen	12604
嘌呤霉素	Enzo Life Sciences	BML-GR312
Opti-MEM I	Invitrogen	31985
丙酮酸钠	Invitrogen	11360
GlutaMAX I	Invitrogen	35050
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140