从转染细菌人工染色体衍生合成RNA的细胞中拯救感染性病毒颗粒

摘要

来源：Yun, S. et al. 细菌人工染色体：正链RNA病毒研究的功能基因组学工具。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了从细菌人工染色体克隆转录的合成RNA中拯救出具有感染性的日本脑炎病毒的过程。视频中演示了如何通过电穿孔将合成RNA导入细胞，使病毒基因组能够指导新病毒颗粒的生成。在感染的细胞单层中形成的噬斑证实了感染性病毒的成功拯救。

方案

1. 测定RNA感染性与病毒产量

1. 将幼仓鼠肾-21（BHK-21）细胞以每皿3 × 10⁶个细胞的密度接种于150 mm培养皿中，在37 °C、5% CO₂条件下培养24小时。
   注意：BHK-21细胞使用添加10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、维生素以及青霉素/链霉素的α最低必需培养基进行维持。
2. 用10 ml冷的A溶液（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8.1 mM Na₂HPO₄和1.5 mM KH₂PO₄）冲洗细胞单层。用4 ml胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（0.25%）处理使细胞从培养皿上脱落，并在台式离心机中以270 × g离心2分钟收集细胞。
3. 在50 ml锥形管中用50 ml冷的A溶液重悬细胞沉淀，于270 × g离心2分钟。重复此洗涤步骤三次；最后一次洗涤后，用A溶液将细胞沉淀重悬至浓度为2 × 10⁷个细胞/ml。
4. 在2 mm间隙电穿孔杯中，将400 µl细胞悬液与2 µg合成RNA混合，并立即在最佳电穿孔条件下使用电穿孔仪进行电穿孔：980 V、脉冲时长99 µsec、5次脉冲（图1C）。
5. 将电穿孔后的细胞在室温（RT）放置10分钟，然后转移至含有600 µl完全培养基的1.7 ml微量离心管中。
6. 在1 ml完全培养基中对电穿孔后的细胞进行10倍系列稀释，并将每种稀释液各取100 µl接种于6孔板中未电穿孔的BHK-21细胞单层（5 × 10⁵）上。
7. 孵育4–6小时后，用含10%胎牛血清的最低必需培养基中添加0.5%琼脂糖覆盖细胞。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育4天。
8. 通过7%甲醛固定并用5%乙醇中的1%结晶紫染色来观察感染灶（空斑）（图2A）。
   1. 可选步骤：转染后18–20小时，通过免疫荧光检测分析RNA电穿孔细胞中的日本脑炎病毒（JEV）蛋白表达（图2B），并在转染后22小时和40小时收集RNA电穿孔细胞的上清液，通过空斑试验进行病毒滴度测定（图2C）。

结果

图1. 从全长JEV SA恢复感染性病毒的示意图₁₄-14-2 互补 DNA（cDNA），在细菌人工染色体（BAC）中组装 (A) cDNA模板的线性化。使用限制性内切酶切割全长JEV BAC，获得线性化模板。 XbaI 并用绿豆芽素（mung bean nuclease, MBN）处理。B) RNA转录物的合成。在存在m的情况下，线性化的cDNA由SP6 RNA聚合酶进行转录⁷G(5')ppp(5')A 帽类似物。C) 合成JEV的回收。 体外 通过电穿孔将体外转录的RNA转染至BHK-21细胞，可产生高滴度的合成病毒。

图2. 来自全长日本脑炎病毒BAC的合成RNA的特异性感染性及合成病毒的回收。 BHK-21细胞经空载电穿孔（Mock）或使用两个独立克隆的全长日本脑炎病毒BAC（Cl.1 和 Cl.2）来源的RNA转录本进行电穿孔。（A）RNA感染性。转染后4天，细胞覆盖琼脂糖并用结晶紫染色。通过感染中心实验测定电穿孔进入细胞的具有感染性的RNA量（左图）。同时展示典型的感染中心图像（右图）。（B）蛋白表达。细胞培养于4孔腔室载玻片中。在转染后20小时（hpt），通过免疫荧光实验分析RNA电穿孔细胞中病毒蛋白的表达，使用抗非结构蛋白1（NS1）兔抗血清作为一抗，Cy3标记的山羊抗兔IgG（红色）作为二抗。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚复染（蓝色）。免疫荧光图像与其相应的微分干涉差图像叠加显示。（C）病毒产量。细胞培养于150 mm培养皿中。通过空斑实验检测转染后22和40小时（hpt）RNA电穿孔细胞培养上清中积累的感染性病毒颗粒的产生情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
α-最低必需培养基	Life Technologies (Gibco)	12561-049
琼脂糖	Lonza	50004
锥形管（50 mL）	VWR	21008-242
结晶紫	Sigma-Aldrich	C0775
培养皿（150 mm）	TPP	93150
电穿孔杯（2 mm 间隙）	Harvard Apparatus	450125
胎牛血清	Life Technologies (Gibco)	16000-044
甲醛	Sigma-Aldrich	F1635	有毒且具致癌性
谷氨酰胺	Life Technologies (Gibco)	25030-081
最低必需培养基	Life Technologies (Gibco)	61100-061
青霉素/链霉素	Life Technologies (Gibco)	15070-063
氯化钾	Sigma-Aldrich	P3911
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P9791
六孔板	TPP	92006
氯化钠	Sigma-Aldrich	S3014
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S3264
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	Life Technologies (Gibco)	25200-056
维生素	Sigma-Aldrich	M6895
CO₂ 培养箱	Thermo Scientific	Heracell 150i
台式离心机	Thermo Scientific	ST16R
电穿孔仪	Harvard Apparatus	ECM 830