滴流和旋转盘反应器使用金黄色葡萄球菌生物膜分析

Summary

详细介绍了利用开放系统流生物膜与滴流反应器和旋转磁盘反应堆的协议。

Abstract

被认为是自然界中最微生物在生物膜表面相关的社区存在。细菌^生物膜 1矩阵内的包裹和连接表面生物膜的形成和发展，通常是在实验室使用批处理系统，如微孔板或流量的研究系统，如流细胞。这些方法，筛选突变体和化学库（微孔板）可视化（流动^池）4 3或生长生物膜。在这里，我们提出两种其他类型的流量系统生物膜生长在金黄色葡萄球菌的详细协议:滴流生物膜反应器和生物膜反应器的旋转盘。

滴流生物膜反应器是专为低剪切条件下生长的生物膜^的研究，5滴流式反应器由四个平行测试通道，每持有一个标准玻璃显微镜玻片大小的优惠券，或导管或限制的长度。滴流式反应器是理想的微传感器监测，一般生物膜研究，生物膜cryosectioning样品，高生物量生产，医用材料的评价，并留置医疗器械^检测 6,7,8,9 。

旋转圆盘式反应器由聚四氟乙烯包含可移动优惠券的^凹槽的磁盘。10可拆卸的优惠券可以由任何可加工材料。旋转盘的底部有一个条形磁铁，让创建跨磁盘旋转液体表面剪切表面冲洗券。 1000毫升的玻璃侧臂的反应堆压力容器是摆在整个磁盘，其中包含18券。液体增长媒体是通过船只的分发，而磁盘是由磁力搅拌器旋转。优惠券是从反应堆压力容器，然后刮下收集生物膜样本作进一步研究或显微成像。旋转圆盘反应器是专为实验室生物杀灭剂的功效，去除生物膜和防污材料的^性能评价。9,11,12,13

Protocol

1。滴流生物膜反应器

1. 滴流生物膜反应器（Biosurface技术或定制设计的版本，通常可以由大学机械厂，看到图1）是组装和​​灭菌。大会涉及商会和保护室盖张贴券。随着生物膜的介质（胰蛋白酶大豆肉汤2克/ L和葡萄糖2克/升），和营养管进水室，高压灭菌消毒。
2. 接种的滴流式反应器是预制反应器放置在一个平面上，夹紧污水管线，灌装用10 mL的胰蛋白酶大豆肉汤每个分庭，加入10μLA S. 金黄色葡萄球菌文化过夜胰蛋白酶大豆肉汤。接种反应器，然后放置在37℃培养箱中培养18小时。
3. 经过18个小时的孵化，松开污水管反应器上放置一个木块切成10 °角。
4. 无菌连接进水每瓶含连续流动的营养肉汤的营养管。饲料油管线运行最高速度（会有所不同取决于泵模型）泵通过泵和总理管。
5. 一旦进水管路催芽停泵和附加连接针（22号，1英寸），每管结束。用乙醇擦拭，并在无菌条件下通过入口塞插入针室入口塞。
6. 打开泵，并允许媒体缓慢滴注（流量〜125μL/分钟）以上的优惠券。从入口塞端口的出水端口，媒体应该沿着票面向下流动。工作在连续流动反应器为2-5天（取决于应用），偶尔会检查适当的排水反应堆。
7. 收获的滴流式反应器生物膜，停泵，并小心取出针头从反应堆。该反应堆可以被放置在一个平面上的优惠券，可在无菌条件下使用无菌镊子去除。如果需要显微镜，优惠券现在可以处理（图2B是滴生物膜反应器中生长的一种金黄色葡萄球菌生物膜的扫描电子显微镜）。如果生物膜的生物量或生理学研究的量化研究的目的，生物膜可以免去券使用细胞刮刀。虽然持有优惠券，用血管钳轻轻刮去票面生物膜的一个锥形管含有磷酸盐缓冲液使用细胞刮刀。注:量化生物膜的菌落形成单位，这是必要的同质化与组织匀浆分解团块，形成一个均匀的悬浮生物膜的收获。组织均质机的各种型号都适合这种应用。我们利用1分钟均质生物膜样品全速费希尔科学Tissuemiser均质机（产品＃15-338-420）。不均质生物膜会导致低估样品中菌落形成单位。

2。旋转盘生物膜反应器

1. 旋转盘生物膜反应器（可从Biosurface技术，或可定制，参见图3）的组装和灭菌。反应堆组装第一名纺成转盘的插槽磁盘券，并放入1升的玻璃烧杯与溢流口。被用作反应堆的第一个孔钻，让媒体流和曝气15胶塞。生物膜反应器，媒体（胰蛋白酶大豆肉汤为2 g / L和葡萄糖2克/升）和入口管再经高压灭菌消毒。
2. 生物膜反应器的旋转盘接种无菌培养基中放置250毫升到反应堆，并加入0.5毫升的一个通宵的S. 金黄色葡萄球菌培养胰蛋白酶大豆肉汤。然后放置在反应堆是不小的轰动板设置到250转和孵育过夜所需的温度。
3. 孵化后16小时内的端口连接的入口管中型水库，将其连接到蠕动泵。然后打开泵和流量设置为〜0.25毫升/分（取决于所需的增长率可以改变流）。
4. 24小时后停止反应器，并在无菌条件下删除不接触生物膜券光盘。使用无菌镊子取出券和浸入每一个磷酸缓冲液，以消除任何松散附着细菌。
5. 对于抗菌化合物测试，该芯片可以被放置到96盘感兴趣的化合物以及包含的个别井。孵育后，转入1 mL含磷酸缓冲液1.5 ml离心管芯片，并与组织匀浆分散完整的生物膜匀浆。
6. 细胞，然后串行稀释和镀营养琼脂培养基上，以确定可行的殖民地formi吴单位。
7. 注:很多变化，可以对上述协议。例如，可涂有旋转盘优惠券或潜在的抗生物膜化合物的疗效进行测试。生物膜分散剂，也可以被孵化券分散化合物和量化附加与分离的细菌进行评估。

3。代表性的成果

一套加快滴流式反应器的一个例子是，如果图1所示。经过三天流会积累丰富的生物膜上的券面，图2A。总生物量会有所不同取决于菌株和精确的生长条件。甲A S.扫描电子显微镜滴流式反应器中生长的金黄色葡萄球菌生物膜如图2b所示。

旋转盘反应器是在图3a所示。描述的协议，可适应一般的任何微生物形成生物膜的能力的具体要求。图3b显示18贴塑料磁盘旋转的光盘。特别适合于这些磁盘生长的生物膜的抗菌测试和产量高可重复性的^结果 11 。

图1。滴流式反应器设置。标记为重要组成部分。

图2的滴流的例子s 金黄色葡萄球菌生物膜。 A）以下的协议描述这种生物膜的生长三天。从反应堆的前两个商会的盖子被删除，显示黄南金黄色葡萄球菌生物膜的生物量。二）Sacnning电子显微镜下的A S.金黄色葡萄球菌生物膜滴流式反应器中生长。

图3。旋转盘堆。一个正在运行的旋转盘反应堆）例。关键部件标记。 b）关闭了一个旋转的磁盘。

Discussion

在不同的反应堆生长的生物膜，往往会产生不同的特点和每个反应器具有不同的应用。在这项工作中，我们描述了两个生物膜反应器的使用:滴流生物膜反应器和一个旋转的磁盘反应堆。滴流电抗器是有用和越来越低气 - 液界面剪切生物膜，适应各种条件。我们发现大量的生物膜生物量是可取的研究极为方便。这种设置可以很容易地适应对涉及的微传感器的监测和测试潜在的antibiofilm表面研究。

旋转圆盘式反应器是用于多个相同的生物膜增长温和的剪切环境下删除磁盘上。该反应堆能够产生可移动磁盘上的多个相同的生物膜，使得它涉及抗菌化合物和生物膜耐表面测试研究的理想。许多应用程序是可能的，在使用这些生物膜反应器，并鼓励研究人员正在修改协议，其具体的研究需求的最佳模式。

这些协议提供流动池，并在过去已被用于更广泛的生物膜的静态检测的替代品。他们还可以提供更大的能力来模拟不同的临床感染。然而，每种技术有潜在的局限性。例如，滴流电抗器和旋转盘反应堆共聚焦显微镜可视化生物膜的理想。此外，在不同类型的反应堆生长生物膜的生理可能会相差很大。例如，滴流式反应器，将导致在被暴露...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
滴流反应器	BioSurface Technologies Corporation	DFR 110
旋转圆盘反应器	BioSurface Technologies Corporation