用于Staphylococcus aureus生物膜分析的滴流式与旋转盘反应器的使用

摘要

详细介绍了利用滴流反应器和旋转盘反应器构建开放式系统流动生物膜的实验方案。

摘要

自然界中的大多数微生物被认为以生物膜中的表面相关群落形式存在。¹ 细菌生物膜被包裹在基质中，并附着于表面。² 生物膜的形成与发展通常在实验室中通过分批系统（如微量滴定板）或流动系统（如流动池）进行研究。这些方法适用于突变体和化合物文库的筛选（微量滴定板）³，或用于培养可供观察的生物膜（流动池）⁴。本文详细介绍了在另外两种流动系统生物膜装置中培养Staphylococcus aureus的实验方案：滴流生物膜反应器和旋转盘生物膜反应器。

滴流式生物膜反应器专为研究在低剪切力条件下生长的生物膜而设计。⁵ 该反应器包含四个平行的测试通道，每个通道可容纳一个标准尺寸的玻璃显微镜载玻片状试片，或一段导管或支架。滴流式反应器非常适合用于微传感器监测、常规生物膜研究、生物膜冷冻切片样品制备、高生物量生产、医用材料评估以及植入性医疗器械的测试。^6,7,8,9

旋转圆盘反应器由一个聚四氟乙烯圆盘构成，圆盘上设有用于放置可拆卸试片的凹槽。¹⁰ 可拆卸试片可由任何可加工材料制成。旋转圆盘底部装有一块条形磁铁，通过磁力驱动圆盘旋转，从而在与表面齐平的试片上产生液体表面剪切力。整个圆盘可容纳18个试片，将其置于一个1000 mL带侧臂的玻璃反应容器中。在圆盘由磁力搅拌器驱动旋转的同时，液体培养基在容器内循环流动。实验结束后，将试片从反应容器中取出，刮取其表面生物膜样品，用于进一步研究或显微成像分析。旋转圆盘反应器主要用于实验室条件下评估杀菌剂效力、生物膜去除效果以及防污材料的性能。^9,11,12,13

方案

1. 滴流生物膜反应器

1. 滴流生物膜反应器（可从 Biosurface Technologies 购买，或由大学机加工车间定制设计，见图1）组装后进行高压灭菌。组装过程包括将试片固定在反应室中，并密封反应室盖。反应室、生物膜培养基（胰蛋白胨大豆肉汤 2 克/升和葡萄糖 2 克/升）以及进液营养管路均通过高压灭菌进行灭菌。
2. 通过将反应器置于水平台面上，夹紧出液管路，向每个反应室中加入 10 mL 胰蛋白胨大豆肉汤，并添加 10 μL 在胰蛋白胨大豆肉汤中过夜培养的 S. aureus 菌液，完成滴流反应器的接种。接种后的反应器随后置于 37°C 培养箱中培养 18 小时。
3. 培养 18 小时后，松开出液管路夹子，将反应器放置在切割成 10° 倾角的木块上。
4. 无菌连接进液营养管路至含有连续流动营养肉汤的瓶子。将管路穿过蠕动泵，并以最大流速（根据泵型号不同而异）运行泵，以排尽管路中的气泡并完成预灌注。
5. 进液管路预灌注完成后，停止泵运行，并在每根管路末端连接穿刺针（22 号，1 英寸）。用乙醇棉片擦拭反应室进液口橡胶塞，然后无菌操作将穿刺针穿过橡胶塞插入。
6. 启动泵，使培养基缓慢滴流（流速约 125 μL/分钟）流过试片表面。培养基应从进液口沿试片表面向下流向出液口。连续流动运行反应器 2 至 5 天（根据实验需求而定），期间应定期检查反应器的排水情况是否正常。
7. 收获滴流反应器中的生物膜时，先停止泵运行，并小心地将穿刺针从反应器上移除。随后将反应器置于水平台面上，使用无菌镊子无菌取出试片。如需进行显微观察，可按相应方法处理试片（图 2B 为在滴流生物膜反应器中培养的 S. aureus 生物膜的扫描电子显微照片）。若实验目标为定量生物膜生物量或进行生理学研究，可使用细胞刮刀将生物膜从试片上刮下。操作时用镊子夹持试片，用细胞刮刀轻轻将生物膜刮入含有磷酸盐缓冲液的锥形管中。注意：若需定量生物膜中的菌落形成单位，必须使用组织匀浆器对收获的生物膜进行均质化处理，以分散菌团并形成均匀悬液。多种型号的组织匀浆器均适用于此操作。我们采用 Fisher Scientific Tissuemiser 匀浆器（产品编号 # 15-338-420）以全速运行 1 分钟对生物膜样品进行匀浆。若未对生物膜进行匀浆处理，将导致样品中菌落形成单位数量被低估。

2. 旋转圆盘生物膜反应器

1. 旋转圆盘生物膜反应器（可从 Biosurface Technologies 购买，或可定制，见图3）组装后进行高压灭菌。首先将旋转圆盘试片插入旋转盘的插槽中，并将其放入带有溢流口的1升玻璃烧杯内，完成反应器的组装。使用带有钻孔的15号橡胶塞作为反应器盖，以允许培养基流动和通气。随后，将反应器、生物膜培养基（胰蛋白胨大豆肉汤 2 g/L 和葡萄糖 2 g/L）以及进样管路通过高压灭菌进行灭菌。
2. 通过向反应器中加入250 mL无菌培养基，并添加0.5 mL在胰蛋白胨大豆肉汤中过夜培养的S. aureus菌液，对旋转圆盘生物膜反应器进行接种。然后将反应器置于设定为250 rpm的磁力搅拌台上，并在所需温度下过夜培养。
3. 培养16小时后，将进样管路连接至培养基储液瓶的接口，并连接至蠕动泵。启动泵并将流速设定为约0.25 mL/min（可根据所需生长速率调整流速）。
4. 24小时后停止反应器运行，并以无菌操作方式取出圆盘，避免触碰生物膜试片。使用无菌镊子取下试片，并将其逐一浸入磷酸盐缓冲液中，以去除松散附着的细菌。
5. 对于抗菌化合物测试，可将芯片置于含有待测化合物的96孔板的各个孔中。培养后，将芯片转移至含有1 mL磷酸盐缓冲液的1.5 mL微量离心管中，并使用组织匀浆器进行匀浆，以分散完整的生物膜。
6. 随后对细胞进行系列稀释，并接种于营养琼脂培养基上，以测定可存活的菌落形成单位。
7. 注意：上述方案可进行多种变异。例如，可将旋转圆盘试片涂覆或直接由潜在的抗生物膜化合物制成，以测试其功效。也可通过将试片在分散剂化合物中孵育，并定量附着与脱离的细菌，来评估生物膜分散剂的效果。

3. 典型结果

图1展示了一个滴流反应器的设置示例。在持续流动三天后，试片表面会积聚大量生物膜，如图2A所示。总生物量会因细菌菌株和具体的生长条件不同而有所变化。图2B显示了在滴流反应器中培养的S. aureus生物膜的扫描电子显微照片。

旋转圆盘反应器如图3A所示。所述方案可针对通常任何能够形成生物膜的微生物的具体需求进行调整。图3B显示了固定有18个塑料圆盘的旋转圆盘。在这些圆盘上生长的生物膜特别适用于抗菌测试，并可获得高度可重复的结果¹¹。

图1. 滴流反应器装置示意图。重要组件已标注。

图 2. 滴流式 S. aureus 生物膜示例。A) 该生物膜按照所述方案培养三天。反应器前两个腔室的盖子已被移除，以显示黄色的 S. aureus 生物膜生物量。B) 在滴流反应器中培养的 S. aureus 生物膜的扫描电子显微图像。

图3. 旋转圆盘反应器。A) 运行中的旋转圆盘反应器示例，关键组件已标注。B) 旋转圆盘的放大视图。

讨论

在不同反应器中培养的生物膜通常具有不同的特性，且每种反应器具有不同的应用。本研究中，我们描述了两种生物膜反应器的使用：滴流生物膜反应器和旋转圆盘反应器。滴流反应器适用于在气液界面培养低剪切力生物膜，并可适应多种条件。我们发现，当需要大量生物膜生物量时，该反应器极为方便。该装置还可轻松改造，用于涉及微传感器监测以及潜在抗生物膜表面测试的研究。

旋转圆盘反应器可用于在可移除的圆盘上、中等剪切力环境下培养多个相同的生物膜。该反应器能够在可拆卸圆盘上生成多个一致的生物膜，因此非常适用于抗菌化合物和抗生物膜表面的研究。使用此类生物膜反应器具有多种应用可能，研究人员可依据具体研究需求对实验方案进行适当修改。

这些方案为过去更常使用的流动池和静态生物膜实验提供了替代方法，也可能更有效地模拟多种临床感染情况。然而，每种技术都可能存在一定的局限性。例如，滴流反应器和旋转盘反应器并不适合通过共聚焦显微镜观察生物膜。此外，在不同类型反应器中培养的生物膜其生理状态可能存在显著差异。以滴流反应器为例，其形成的生物膜会暴露于严重的营养梯度环境中，这与...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
滴流式反应器	BioSurface Technologies Corporation	DFR 110
旋转盘反应器	BioSurface Technologies Corporation