蜱虫中的RNA干扰

摘要

介绍了一种通过向未进食蜱虫注射双链RNA（dsRNA）进行RNA干扰（RNAi）的方法。RNAi是蜱虫中最常用的基因沉默技术，因为在蜱虫中其他遗传操作方法的应用受到限制。

摘要

蜱是野生和家养动物及人类体表专性吸血的外寄生虫，被认为是全球范围内仅次于蚊子的人类疾病传播媒介¹，也是影响全球畜牧业最重要的传播媒介²。蜱分类上属于蛛形纲蜱螨亚纲、寄螨目、硬蜱亚目，全球分布，从北极地区至热带地区均有发现³。尽管已采取多种措施控制蜱的侵扰，这些外寄生虫仍对人类和动物健康构成严重威胁^4,5。

RNA干扰（RNAi）⁶是一种基于核酸的反向遗传学方法，通过干扰基因表达来确定基因功能或其对代谢通路的影响。小干扰RNA（siRNA）是RNAi通路中的效应分子，该通路由双链RNA（dsRNA）启动，导致细胞质中与dsRNA触发序列相同的mRNA发生强烈且序列特异性的降解^7-9。迄今为止研究的所有真核生物中均发现了由dsRNA引发的转录后基因沉默机制，RNAi已迅速发展成为多种生物体中用于功能基因组学研究及其他应用的重要工具¹⁰。

RNAi 已成为在蜱虫及其他缺乏或无法可靠实施基因操作替代方法的生物体中使用最广泛的基因沉默技术^5,11。直到最近应用 RNAi 技术之前，对蜱虫的遗传学表征一直十分有限^12,13。在 RNAi 技术可用后的短时间内，它已被证明是研究蜱虫基因功能、蜱虫-病原体相互作用界面以及蜱源保护性抗原的筛选与表征的有力工具¹⁴。本文描述了一种通过向未吸血蜱虫注射 dsRNA 实现 RNAi 的方法。通过该实验方法所获得的知识，有望显著促进人们对基础生物系统的理解，并推动用于控制蜱虫侵染及阻断蜱传病原体传播的疫苗的研发^15-19。

方案

1. 生成双链RNA。

1. 合成含有T7启动子序列的寡核苷酸引物 体外 转录与dsRNA的合成（例如，用于 Dermacentor variabilis subolesin 使用寡核苷酸引物 D8AAT75：
   5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3' 和 D8DVT73：5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3'）
2. 使用10 pmol的每种寡核苷酸引物和1-10 ng蜱总RNA，通过RT-PCR扩增目标基因。
3. 纯化PCR产物。
4. 使用以下方法合成dsRNA 8 μL 纯化后的PCR产物
5. 通过分光光度法定量dsRNA。

2. 用dsRNA注射蜱虫。

2.1. 注射用蜱虫的准备。

1. 首先，将蜱虫置于一系列溶液中进行清洗：将蜱虫放入50 mL一次性离心管中，振荡混匀，然后通过覆盖在管口的细孔金属筛网倾倒溶液，以保留蜱虫。清洗蜱虫的溶液顺序为自来水、3%过氧化氢、两次蒸馏水洗涤、70%乙醇，再用蒸馏水洗涤两次。
2. 用纸巾将蜱虫吸干。
3. 根据实验需要，将蜱虫按每组20至50只进行计数，将每组蜱虫放入一个1.25盎司带紧密盖子的塑料杯中，并标记实验组编号。

2.2. 蜱虫注射团队。

RNAi 实验团队由三人组成：（1）一人负责将每只蜱虫放置在固定于红色牙科蜡片上的双面胶带上，（2）一人负责对蜱虫进行注射，（3）一人负责在注射后监测蜱虫，向蜱虫呼出 CO₂ 以激活其活动，并将存活的蜱虫计数后放入标有实验组编号的容器中。所有团队成员均须佩戴一次性手套。

2.3. 注射用蜱虫的放置。

1. 使用 Dumont 精细镊子捕捉一只蜱虫，并将其腹面朝上放置在固定于 3 英寸 × 6 英寸红色牙科蜡片上的双面胶带上。将 5 只蜱虫紧密地成组放置。
2. 用一小条遮蔽胶带覆盖这 5 只蜱虫的口器部分，以进一步固定它们，同时保持虫体大部分暴露，以便蜱虫注射操作者能够观察注射过程（图 1）。

2.4. 蜱虫注射。

1. 将在外骨骼腹面右下象限注射蜱虫。
2. 首先使用配有½英寸、29号针头的Monoject胰岛素注射器在外骨骼上刺出一个小孔（图2a）。
3. 立即使用定制的Hamilton注射器（配1英寸、33号针头，尖端呈45°斜面）向蜱虫注射0.2–0.5 μL的dsRNA溶液（每μL含5 × 10¹⁰ – 5 × 10¹¹ 个分子）（图2b）。应将针头充分插入蜱虫体腔，以确保dsRNA的准确定位和保留。部分液体可能从注射部位溢出（图2c）。注射时应注意避免过量，否则会导致血淋巴流失，可能引起蜱虫死亡。
4. 每完成一个实验组的注射后，需清洁Hamilton注射器，再用于下一个实验组。先从盛有3%过氧化氢的烧杯中吸取液体，然后排入废液容器，重复15次；再从盛有无菌水的烧杯中吸取液体，排入废液容器，同样重复15次。操作时应注意避免弯曲Hamilton注射器的推杆，一旦弯曲，推杆将无法顺畅移动，影响注射蜱虫时所需的轻柔操作。

2.5. 注射后蜱虫的处理。

1. 用精细镊子立即从双面胶带上拾取已注射的蜱虫，并将其放入塑料回收容器中（约6英寸×6英寸，容器边缘贴有遮蔽胶带以防止蜱虫逃逸）。蜱虫在注射后会短暂地不活跃，但很快应开始在容器内爬行。
2. 呼出气一氧化碳₂ 将蜱虫放入恢复容器后，立即施加刺激以帮助激活蜱虫。一旦蜱虫开始爬行并恢复活动，注射造成的伤口将迅速愈合，其存活概率显著提高。
3. 根据实验分组数量统计蜱虫，并将其放入带有紧密盖子的标记塑料杯中。在注射下一实验组之前，应注射备用蜱虫以替换任何已死亡的蜱虫。

2.6. 蜱虫的保存。

1. 将蜱虫置于湿度培养箱中（12小时光照：12小时黑暗光周期，温度22–25°C，相对湿度95%），保持1天。
2. 将蜱虫放入蜱虫饲喂装置中，每个实验组一只，将其粘附于绵羊体表，并让其与等量未注射的雄性或雌性蜱虫（选择未注射的性别）共同吸血。收集吸血至饱血的雌性蜱虫，或在饲喂10天后、或当对照组雌性蜱虫自然脱离宿主时将其从绵羊身上取下，并进行称重。
3. 将蜱虫放入纸盒中，继续置于湿度培养箱内直至产卵完成。通过称量该组所有蜱虫所产卵块的总质量来评估产卵情况。

2.7. RNAi后蜱表型的分析。

1. 通过测定饱血后存活的蜱虫数量、蜱虫体重、产卵情况及卵的孵化率，评估蜱虫的表型。然而，根据靶向基因及研究目的的不同，也可进行其他分析。

3. 通过RT-PCR分析验证基因沉默效果。

1. 在取食后，从对照组注射和dsRNA注射组的个体蜱虫中解剖分离唾液腺和肠道。
2. 从各个组织样本中提取总RNA。
3. 通过实时RT-PCR分析各组织中靶基因的转录水平，并使用genNorm方法（Bio-Rad iQ5标准版2.0版本中实现的ddCT方法）以蜱虫16S rRNA为内参对RNA水平进行归一化。
4. 在反应结束后运行解离曲线，以确保仅形成单一扩增产物，并且每个样本的扩增产物均在相同的温度范围内一致解链。
5. 使用Student's t检验（P=0.05）比较对照组注射与dsRNA注射蜱虫之间的mRNA水平（归一化的Ct值）。

4. 代表性结果：

本文所述方案已在我们的实验室中用于多种硬蜱科蜱类的RNA干扰实验（表1）。注射到蜱体内的dsRNA量需根据蜱的大小进行调整；体型较大的蜱种可容纳更大的注射体积。阴性对照组蜱应注射无关的dsRNA。可使用多种dsRNA作为阳性对照，例如subolesin^{14-19,22-25,27-32,34}和beta-actin^20,21。请注意，在不同处理之间必须清洗注射器，以避免dsRNA溶液交叉污染。若操作正确，注射后24小时内蜱的死亡率应低于5%。图3展示了蜱基因敲低后的典型表型，其中一组蜱被注射了多种dsRNA混合物，用于筛选蜱保护性抗原。

蜱虫种类	注射dsRNA	参考文献
Ixodes scapularis	cDNA文库，subolesin，肌动蛋白，核苷酸酶，NF-kB，akirin	21, 22, 29, 30
Dermacentor variabilis	亚铁蛋白1，蛋白酶体26S亚基，肌动蛋白，变异性蛋白，亚铁蛋白1，硒蛋白M和W2a，造血干细胞/祖细胞样蛋白，vATP酶，泛素，GST，亚基蛋白	15, 19, 22, 24, 26, 30-32
Dermacentor marginatus	subolesin	22
Amblyomma americanum	cDNA文库，subolesin，akirin	17, 22, 30
Amblyomma hebraeum	subolesin，voraxin	28
Rhipicephalus sanguineus	Rs86，亚基蛋白	22, 23
微小牛蜱	GST、泛素、硒蛋白、Bm86、Bm91、subolesin、GI、GIII、EF1a、鞭状丝蛋白、von Willebrand因子 因子	16, 18, 25, 27
Rhipicephalus annulatus	泛素，subolesin，EF1a，GIII	16

表1.已应用RNAi实验方案的蜱虫物种。

图1. 将蜱虫腹面朝上放置于粘附在红色牙科蜡片上的双面胶带上。每5只蜱虫为一组放置，随后在口器部位覆盖一小条医用胶带，以进一步固定蜱虫，同时便于注射时观察蜱虫体部。

图 2. 注射操作包括：(a) 使用装有29号针头的胰岛素注射器刺入蜱虫外骨骼的右下象限，以创建注射位点；(b) 在该位点立即使用配有33号针头的汉密尔顿注射器注入dsRNA；(c) 此过程很可能导致部分蜱虫血淋巴/体液外泄。

图3. 采用RNA干扰技术筛选美洲钝眼蜱（Amblyomma americanum）保护性抗原的六组蜱虫实验面板。通过与阳性对照（subolesin RNAi）和阴性对照（无关dsRNA）比较，可观察到蜱虫的表型变化。本实验对各组RNA干扰在蜱虫死亡率、体重及产卵量方面的影响进行了统计学分析。

讨论

尽管已有其他方法用于蜱虫的RNA干扰（RNAi）^{14, 33}，但本文所述的双链RNA（dsRNA）注射方法在未吸血（表1）和已吸血蜱虫中应用最为广泛^16,25,34。研究表明，RNAi是研究蜱虫基因功能、蜱虫-病原体相互作用界面特征以及蜱源保护性抗原的筛选与鉴定的有力工具^14,35。特别是，RNAi已成为蜱虫功能分析中最有效的技术手段³⁵。

从方法学角度来看，RNAi 将可能发展出更为高效的技术，从而实现在大量个体中进行基因敲低。应进一步优化dsRNA诱导的蜱虫RNAi机制，以促进对该物种中这一遗传学方法的深入理解与应用^35,36。RNAi在蜱虫中可能产生的脱靶效应程度，也是一个亟待全面解决的重要问题^14,27。最终，RNAi 很可能将为研究蜱虫的基因调控、系统生物学以及蜱-病原体相互作用提供全面的贡献，并可能对防控蜱虫侵染及蜱传病原体传播的疫苗研发产生重要影响。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Access RT-PCR 系统	Promega	A1250
Purelink PCR 纯化试剂盒	Invitrogen	K3100-02
Megascript RNAi 试剂盒	Ambion	AM1626M
红色牙科蜡	Electron Microscopy Sciences	72674
塑料杯，1.25 盎司及杯盖	Solo Cup Company, Urbana Ill.
精细镊子	Electron Microscopy Sciences	各种规格
胰岛素注射器	Monoject		配备 ½"、29 号针头
Hamilton 注射器	Hamilton	701SN,33/.375”/45DGR	定制
TriReagent	Sigma	93289
iScript One-Step RT-PCR 试剂盒（含 SYBR Green）	Bio-Rad	170-8892
实时 PCR 检测系统	Bio-Rad	多种型号	请参见 http://www.bio-rad.com/