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从骨骼肌中纯化前体细胞

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DOI：

10.3791/2476

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2011年3月16日

 , 
1The Biomedical Research Centre, University of British Columbia

本文内容

摘要

从小鼠骨骼肌中通过酶解分离、表面标记及流式细胞术纯化纤维/脂肪生成和肌源性前体细胞的方法。

摘要

骨骼肌包含多种具有不同胚胎起源和发育潜能的前体细胞群体。肌源性前体细胞通常位于肌纤维质膜与包裹肌纤维的富含层粘连蛋白的基底膜之间的“卫星细胞位置”，是一类能够自我更新且仅向肌源性谱系分化的细胞。1,2我们最近描述了第二类与血管相关的前体细胞，这类细胞能够生成肌成纤维细胞和白色脂肪细胞，在组织损伤时可迅速进入增殖状态，并在组织再生过程中为成肌细胞提供营养支持3,4确定特定细胞群发育潜能和再生能力最可靠的检测方法之一是基于细胞的分离与移植5-7为此，我们优化了通过流式细胞术从酶解分离的肌肉组织中纯化这些细胞的实验方案，本文将对此进行详细阐述。采用该方法获得的细胞群体将包含成肌性或成纤维/成脂性集落形成细胞：无其他细胞类型能够扩增 体外 或存活 体内 递送。然而，当这些细胞群体在分选后立即用于分子分析（例如 qRT-PCR）时，必须注意，新近分选的亚群可能含有其他无法形成克隆或在受体中植入的污染细胞。

方案

1. 组织采集：

  1. 使用 7 至 12 周龄的小鼠。通常至少需要两只动物：其中一只用于建立流式细胞术（FACS）单色对照，以进行补偿调节，以及设置荧光减一（fluorescence-minus-one）同型对照样本；另一只为实际待分选的样本。
  2. 通过吸入 CO2 或根据所选伦理协议安乐死小鼠。将小鼠仰面放置于纸巾上，并用 70% 乙醇充分喷洒，以防止小鼠毛发造成污染。
  3. 用镊子提起腹部区域的皮肤，然后用锋利的剪刀做一个小的纵向切口。
  4. 将两侧皮瓣分别向上和向下剥离，完全暴露下方的后肢肌肉。
  5. 将剪刀插入胫骨两侧并展开，以切除肌肉组织。
  6. 对股骨重复相同操作，以提取肌肉组织。
  7. 将所有切除的肌肉组织置于 60 mm 培养皿中，每只小鼠使用一个独立的培养皿。
  8. 对所有小鼠重复上述步骤。

2. 通过酶消化将组织解离为单个细胞：

在本方案的整个部分中，均应使用无菌试剂和工具，并在无菌条件下操作。

  1. 向每个培养皿中加入 2 mL 胶原酶 II（Sigma，货号#6885，500 U/mL）和 20 μL 的 250 mM CaCl2 储存液。
  2. 使用两把镊子（一把带齿，一把双齿，来自 Fine Science Tools，货号#11051-10，11154-10）将肌肉组织撕成小块（约 1 mm3），注意尽可能去除并丢弃受污染的非肌肉组织。
  3. 盖上培养皿，于 37 摄氏度孵育 30 分钟。
  4. 取出培养皿，使用 3 mL 注射器活塞充分研磨组织块。每个样品使用单独的活塞，以避免交叉污染。
  5. 向每个培养皿中加入约 5 mL 无菌冷 PBS，并将组织悬液转移至 50 mL Falcon 管中（必要时冲洗培养皿以回收全部组织）。
  6. 剧烈震荡 Falcon 管，加满 PBS，以 800 rpm 离心 5 分钟（Eppendorf 台式离心机型号：5810R），吸除上清液（重复 3 次）。
  7. 向每管中加入 1 mL 胶原酶 D（Roche，货号#11088882001，1.5 U/mL）与 Dispase II（Roche，货号#04942078001，2.4 U/mL）的混合液，以及 10 μL 的 CaCl2（250 mM），于 37 摄氏度旋转孵育 1 小时。
  8. 加入 5–10 mL 冷的无菌 PBS，涡旋并用移液器充分吹打以均质化组织。
  9. 用 PBS 加满各管并充分混匀。
  10. 将液体转移至置于 50 mL Falcon 管上方的 40 μm 细胞滤器中，以滤除残留的大块组织。将每个样品平均分至三个 50 mL Falcon 管中，每管加满 PBS 后于 8 摄氏度以 1600 rpm 离心 5 分钟。
  11. 弃去上清液，收集细胞用于染色。

3. 抗体染色与分选：

在本实验方案的此部分中，使用无菌的流式细胞术（FACS）缓冲液和收集缓冲液，并在无菌条件下操作。商业化的抗体若经过适当处理，通常被视为无菌。

  1. 对于单色和同型对照样本，将样本重悬于1 mL FACS缓冲液中，并将悬浮细胞分装至9个预先标记的1.5 mL离心管中（100 μL 每管）
    1. 根据下表设置单色染色混合液：
      注意：同型对照抗体在染色中的终浓度应与其对应的初级抗体浓度一致。例如，如果使用了抗-Sca-1抗体，则相应的同型对照抗体 1 μg/106 细胞，其相应的同型对照必须以相同浓度使用。
      管编号 #试管名称公司货号#克隆同型型稀释
      1非染色     
      2Hoechst33342sigmaB2261  2-5 μg/ml
      3PIsigmaP4864  1 μg/ml
      4CD31-FITC

      CD45-FITC      		ebioscience11-0311-85390大鼠 IgG2a500
      自制 I3/2大鼠 IgG2b500
      5Sca1-PECY7ebioscience25-5981-82D7大鼠 IgG2a5000
      6α-7 APC自制 R2F2大鼠 IgG2b1000
    2. 使用下表设置同型对照染色混合液：
      管 #名称
      管的      		HoechstPICD31-
      FITC      		CD45-
      FITC      		Scal-
      PE-CY7      		a-7-
      APC      		大鼠-
      IgG2b-
      APC      		大鼠-
      IgG2a-
      pecy7      		大鼠-
      IgG2a-
      FITC      		大鼠-
      IgG2b-
      FITC
      7同-
      CD31
      /CD45      		++--++--++
      8Iso-
      Scal-
      pecy7      		++++-+-+--
      9Iso-
      α-7-APC      		+++++-+---
    3. 移液单色和同位素对照染色混合物（我们通常调整抗体浓度，使其在5至 10 μL 将染色混合液（每份样本加入适量）从第20步加入相应的Eppendorf管中，充分混匀，冰上孵育1小时。
  2. 对中国台湾样本小鼠的细胞进行染色 800μL 抗体混合物（如下）用于FACS细胞分选。充分混匀，冰上孵育1小时。
    抗体混合物： Hoechst、PI、CD31-FITC、CD45-FITC、Sca1-PECY7、α-7 APC
    注意：抗体与细胞的最佳比例必须通过 individually 滴定每种抗体来确定，因为不同批次之间可能存在显著差异。应以 μgs 每10个抗体6 靶细胞数量在使用同一批抗体时应保持恒定。显然，如果不同实验之间的靶细胞数量没有显著变化，或者染色体积随细胞数量按比例调整，则也可使用每种抗体的固定稀释比例。
  3. 洗涤：向9个对照管中每管加入约1 mL FACS缓冲液；向样本管中加入约20 mL FACS缓冲液。
  4. 将Eppendorf管在3000 rpm下离心5分钟（Eppendorf台式离心机，型号：5417C）。将样品管在1600 rpm下离心5分钟（Eppendorf台式离心机，型号：5810R）。
  5. 吸出并弃去所有试管中的上清液。
  6. 用FACS缓冲液重悬细胞（每个对照样本1 mL，分选样本4 mL），通过细胞滤器帽（BD Falcon货号# 352235）将细胞移入“FACS管”中， 40μm 孔径）以去除可能影响流式细胞仪的残留团块。
  7. 使用单色对照和同型对照设置流式细胞分选仪。
  8. 根据下表，将分选后的细胞分别收集至含有3.5 mL收集缓冲液（95% DMEM，5% FBS）的容器中。通常情况下，取自一只野生型小鼠的双侧后肢组织，可获得约150,000个成肌前体细胞或100,000个成脂前体细胞，细胞活力高于95%，该结果通过分选结束后采用FACS对细胞进行重新分析确认（图1）。
    基于表面染色定义成肌细胞和成脂细胞前体细胞
    抗体/染色 成肌祖细胞（MP）脂肪生成祖细胞（AP）
    Hoechst++
    PI--
    CD31-FITC--
    CD45-FITC--
    Sca1-PECY7-+
    α-7 APC+-

4. 移植：

  1. 将分选后的细胞以1500 rpm离心5分钟，弃上清，将细胞转移至已灭菌的Eppendorf管（1.5 mL）中，用500 μL无菌PBS（无血清！）洗涤细胞，随后以3000 rpm离心5分钟。所有试剂均需保持无菌条件，并在组织培养超净台中操作，将成肌前体细胞重悬于PBS中，或将成脂前体细胞重悬于Matrigel（BD货号# 354234）中，浓度约为106 细胞/mL。
  2. 将成肌前体细胞或成脂前体细胞移植至受体小鼠。
    1. 根据所在机构的规定，使用异氟烷对小鼠进行麻醉。
    2. 剃除注射区域周围的毛发，然后用70%乙醇擦拭消毒皮肤。
    3. 使用3/10 CC胰岛素注射器（BD货号# 309300）注射20 μL的成肌前体细胞或成脂前体细胞（= 20,000个细胞）。
  3. 在适当时间后（三周效果良好，但通常移植后一周内即可观察到表达供体来源转基因标记的肌纤维），通过腹腔注射400 μL Avertin（Sigma货号# T04840-2，25 mg/mL）麻醉第29步中的受体小鼠，随后先经心脏灌注50 mL PBS（含10 μM EDTA），再灌注15 mL 4% PFA。取目标组织，如需则在4% PFA中后固定过夜，然后转移至20%蔗糖溶液中过夜。用OCT包埋，冷冻并进行冰冻切片。

5. 典型结果：

当移植肌源性前体细胞至小鼠骨骼肌时，它们会迅速与已存在的肌纤维融合。因此，供体细胞中存在的任何遗传标记均可在接收这些细胞的肌纤维中轻松检测到。图2展示了一个示例，其中移植的细胞表达人源性碱性磷酸酶，并通过组织化学方法显示。

当脂肪前体细胞被移植时，其结果高度依赖于移植部位的微环境：当皮下移植时，这些细胞会分化为脂肪细胞和肌成纤维细胞（见图2）。在包括肌肉在内的许多其他部位，除非已诱导产生脂肪变性，否则这些细胞无法存活3。

流式细胞术分析图；FL8-A：APC 对 FL6-A：PECγ；细胞群设门。
图1. 从骨骼肌中分离祖细胞群的分选策略。 （A）分选策略：根据前向散射光和侧向散射光确定活细胞。利用Hoechst染色排除无核碎片，并通过碘化丙啶（PI）染色排除死细胞。在分选门控中排除造血细胞（CD45）和内皮细胞（CD31）。α7+ Hoechst+ PI- CD45- CD31- Scal- 亚群包含所有肌源性祖细胞（MP）。Scal+ Hoechst+ PI- CD45- CD31- α7- 群体包含脂肪源性祖细胞（AP）。（B）荧光减一（FMO）同型对照验证染色特异性。（C）分选后MP和AP亚群的纯度检测。

用于细胞结构鉴定的组织学切片染色；显微镜实验结果。
图 2. MP 和 AP 移植后的代表性结果。 AP 被移植至皮下（上图），MP 被移植至肌肉内（下图）。在这两种情况下，供体细胞均来自表达转基因人源碱性磷酸酶的小鼠，该酶通过棕色染色进行识别。

讨论

本方案的目标是在获得高细胞产量与高细胞活性之间实现合理平衡。可以预见，确保获得健康细胞最关键的一步是起始组织的酶解离过程。组织操作应特别轻柔，这一点即使在音视频格式中也难以展示或体会。另一个关键因素是操作时长：从供体到受体动物的时间越长，细胞活性越低，因而移植效率也越低。如果在分选后通过观察纯化细胞样本中PI阳性事件的频率仍无法立即判断细胞活性，建议进行有限稀释实验以测定克隆形成能力3。通常情况下，从未受损肌肉组织中分离得到的细胞，约每15-20个细胞中就有1个能够在体外启动成肌或成纤维/成脂克隆的形成。in vitro。虽然由肌肉前体细胞（MPs）形成的克隆中几乎100%含有已分化的肌管，而由纤维/脂肪前体细胞（FAPs）形成的克隆中，仅有约三分之一同时含有脂肪细胞和表达平滑肌肌动蛋白的肌成纤维细胞。

披露

未声明任何利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胶原酶 IISigma-AldrichC-6885,500 u/ml
胶原酶 DRoche Group110888820011.5 u/ml
Dispase IIRoche Group049420780012.4 u/ml
细胞筛BD Biosciences35234040 μm
带细胞筛的离心管BD Biosciences35223540 μm
H–chst33342Sigma-AldrichB22612-5 ug/ml
CD31-FITCeBioscience11-0311-85克隆 390
CD45-FITC自制克隆 I3/2
Sca1-PECY7eBioscience25-5981-82克隆 D7
α-7 整合素 APC自制请联系 Rossi 实验室R2F2

参考文献

  1. Buckingham, M., Montarras, D. Skeletal muscle stem cells. Curr Opin Genet Dev. 18, 330-336 (2008).
  2. Relaix, F., Marcelle, C. Muscle stem cells. Curr Opin Cell Biol. 21, 748-753 (2009).
  3. Joe, A. W. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).
  4. Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration. Cell Cycle. 9, (2010).
  5. Sherwood, R. I. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119, 543-554 (2004).
  6. Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. , (2008).
  7. Montarras, D. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).

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祖细胞流式细胞术组织解离酶消化细胞分选成肌祖细胞成脂祖细胞荧光激活细胞分选细胞活力
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