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在三维神经干细胞培养中定位蛋白质：一种混合可视化方法学

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DOI：

10.3791/2483

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2010年12月19日

 ,  ,  , 
1Neural Regeneration Laboratory and Ottawa Institute of Systems Biology, Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 2Carleton Immersive Media Studio, Azrieli School of Architecture and Urbanism, Carleton University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了如何在三维（3D）培养条件下生成、扩增并进行免疫标记出生后海马神经前体细胞（NPCs）。接着，通过结合使用混合可视化技术，我们展示了如何利用免疫标记的冷冻切片数字图像，对整个三维神经球中免疫阳性细胞的空间位置进行重建与定位 mapping。

摘要

三维（3D）拓扑结构对神经干细胞和祖细胞（NPC）表型的影响已得到广泛认可，但研究起来仍具挑战性。当从胚胎期或出生后脑组织中分离出单个NPC时，这些细胞会在悬浮培养中增殖并形成神经球。尽管处于相同的细胞外环境，这些培养物中的子代细胞在扩增过程中会自发地分化为不同的发育谱系（神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞）。这一过程重现了出生后脑组织中神经发生和胶质发生所经历的多个阶段，常被用于在受控环境中研究NPC的基本生物学特性。然而，要全面评估3D拓扑结构以及细胞在这些培养物中的空间位置对NPC命运的影响仍然困难。为了通过免疫细胞化学方法定位目标蛋白并鉴定NPC的谱系，必须将自由漂浮的神经球接种于基质上或进行连续切片。该处理步骤对于确保抗体在整个神经球内均匀渗透和结合至关重要。因此，冷冻切片的二维落射荧光图像或三维Z轴堆栈的共聚焦重建图像仅能提供细胞在离散的物理或数字3D切片中的空间位置信息，而无法呈现细胞在完整神经球内的实际空间分布。本文中，为重现神经球培养的拓扑结构，并实现对整个培养体系中蛋白表达的空间分析，我们提供了一种适用于落射荧光或共聚焦免疫检测目标蛋白的出生后海马神经球的分离、扩增及连续切片实验方案。以连接蛋白29（Connexin29, Cx29）作为分析示例。接着，通过严格应用图形编辑与3D建模软件的结合方法以保持生物学细节，我们描述了如何重建这些图像的3D结构定位，并在完整的神经球内对标记细胞进行数字化定位。该方法可实现对整个3D培养拓扑结构中目标蛋白和细胞的空间位置进行可视化与分析，将有助于更深入地研究体外神经发生和胶质发生过程中细胞间空间关系的动态变化 in vitro。

Imbeault 和 Valenzuela 贡献相同，应被视为共同第一作者。

方案

1. 神经前体细胞的分离

分离过程中始终将组织和溶液保持在低温状态！

  1. 开始培养前，请配制以下储备液：
    • 解离培养基（26 mM NaHCO₃）3，124 mM NaCl，5 mM KCl，0.1 mM CaCl2*2H2O，3.2 mM MgCl2*6H2O₂，10 mM D-葡萄糖，100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 链霉素。经无菌过滤后，分装为10–15 mL等份，于-20°C保存。将用于细胞解离的酶配制成双蒸水中的储备液，浓度如下：2O，经无菌滤膜过滤后，分装并储存在 -20°C：神经蛋白酶（25 mg/mL）、木瓜蛋白酶（10 mg/mL）、DNA酶I（10 mg/mL）。实验当天，将上述酶加入15 mL解离培养基中，终浓度分别为：蛋白酶1 mg/mL、木瓜蛋白酶0.1 mg/mL、DNA酶I 0.1 mg/mL。含有终浓度酶的解离溶液可在冰上保存，用于解剖过程。
    • 维持培养基：DMEM/F12 培养基、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、1× B27 添加剂。不含 B27 添加剂时可在 4°C 保存最长 3 个月，含 B27 添加剂时可在 4°C 保存最长 1 个月。
    • 生长因子：在 DMEM/F12 培养基中加入 0.1% 牛血清白蛋白（BSA），配制人重组表皮生长因子（hEGF）浓度为 0.1 μg/mL 和成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）浓度为 10 μg/mL 的储存液分装 aliquot。于 -20°C 保存。
  2. 为对C57BL/6小鼠幼崽实施致死性麻醉，可在出生后0至3天内通过腹腔注射Euthansol。
  3. 小心地通过标准解剖方法取出脑组织，并置于含有人工脑脊液（ACSF：26 mM NaHCO₃）的60 mm培养皿中保存。3，124 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM CaCl2*2H2O, 1.3 mM MgCl₂2*6H2O、10 mM D-葡萄糖、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素）。必要时将pH调至7.3，经无菌过滤后分装为50 mL等份，于-20°C保存。
  4. 使用剃刀片切除小脑以修块脑组织，然后用Krazy Glue将脑组织腹侧朝向操作者、头端朝上固定于振动切片机的卡盘上。本方案使用的是Leica Microsystems VT1000S振动切片机。
  5. 将样本夹持器置于振动切片机中，并在相应区域加入人工脑脊液（ACSF）和冰块。
  6. 使用3.5–4.5的速度和8.5的频率切割成500 μm厚的切片。
  7. 收集含有海马结构的脑片至盛有ACSF的培养皿中。
  8. 使用体视显微镜，剥离位于前囟后1.60 mm至2.40 mm之间（直至CA3区开始向腹侧弯曲）的海马组织，并置于新的干燥培养皿中（不含ACSF）。本方案使用Leica MZ6解剖显微镜。
  9. 所有海马体采集完毕后，用手术刀切碎组织（直至呈现均匀液化的外观）。
  10. 将切碎的组织转移至一个含有 2.5 mL 消化液（含神经组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和 DNA 酶 I，消化液配制见步骤#1）的 15 mL 聚丙烯离心管中。若组织量较多（例如来自 6 只仔鼠），建议使用两管 2.5 mL 消化液，以维持最佳的酶与组织比例。在 37°C 条件下旋转孵育 45–60 分钟。本实验方案使用 Labnet ProBlot 6 杂交炉（通过 Mandel Scientific 购买），旋转速度设定为 4。
  11. 加入10 mL无菌组织培养用磷酸钾缓冲液（kPBS：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4），在300 × g下离心5分钟。本方案使用Eppendorf离心机（型号5702）。
  12. 弃去上清液，将沉淀重悬于5 mL kPBS中。
  13. 通过巴斯德移液管吹打重悬组织以实现解离。
  14. 将细胞悬液在300 x g下离心5分钟。
  15. 在3 mL维持培养基中重悬细胞，使用台盼蓝计数细胞，并以2.5 × 10⁵个/mL的密度将细胞接种于60 mm非黏附培养皿中（本实验方案使用Corning超低黏附结合培养皿，参见材料部分）5 5 mL 维持培养基中的细胞/培养皿。可使用普通培养皿替代超低吸附培养皿，但在扩增的前6天内，每天上午和下午均需轻敲培养皿 体外 （DIV）以防止贴壁和自发分化。
  16. 接种后立即加入hEGF至终浓度20 ng/mL，以及FGF-2至终浓度10 ng/mL。在扩增阶段每两天补充一次额外的生长因子，直至DIV 14收集日。（视频中扩增神经球的标尺代表100 μm。）

**注意：扩增阶段第10天左右，培养基可能会变黄。如果出现此情况，需添加1 mL维持培养基。若次日培养基再次变黄，则继续添加1 mL维持培养基——在扩增阶段根据需要持续进行此操作——注意相应调整生长因子的添加量，以维持正确的终浓度。

2. 连续冷冻切片

  1. 固定前轻轻轻敲神经球，以确保在固定时神经球充分分离。
  2. 直接向培养物中加入分子级甲醛，使其终浓度为3.7%，于室温（RT）下缓慢振荡孵育20分钟。本实验方案使用Stovall Belly Dancer，设定转速为2.5。
  3. 将神经球收集至15 mL聚丙烯离心管中，在300 × g条件下离心5分钟。
  4. 弃去上清液，将沉淀重悬于10 mL磷酸钠缓冲盐水（nPBS：154 mM NaCl，10 mM磷酸缓冲液）中。注意此处溶液由kPBS更换为nPBS。
  5. 在300 × g条件下离心5分钟。
  6. 将沉淀重悬于5–10 mL含20%蔗糖（w/v）的nPBS溶液中。
  7. 将神经球置于4°C条件下至少24小时，以实现培养物的冷冻保护。
  8. 用最佳切割温度（OCT）包埋剂填充一次性冷冻模具。
  9. 将含有神经球的蔗糖溶液轻轻倒入培养皿中。
  10. 使用体视显微镜寻找大小具有代表性的神经球，并尽量选择机械损伤最小的样本。初次操作时，部分培养物可能出现破裂或撕裂，但随着操作熟练，形态结构将得以良好保持。
  11. 用1 mL移液器吸头轻柔吸取每个神经球（尽量减少带出的蔗糖溶液量），将其置于OCT包埋剂中。在模具上标记大致位置，以便后续定位神经球。
  12. 将数个神经球放入冷冻模具后，使用CO2快速冷冻样品，直至OCT变为白色。
  13. 在冰冻组织块上标记神经球的位置，然后将组织块从模具中取出。
  14. 使用预冷的镊子，将组织块放置于已用OCT固定在持样器上的滤纸上。
  15. 在组织块周围添加更多OCT包埋剂，并用CO2冷冻，使含有神经球的组织块牢固粘附。或者，也可将持样器（带滤纸）放入冷冻切片机中，在滤纸上滴加OCT包埋剂，然后直接将组织块放入OCT中，待OCT变白变硬即可。本实验方案使用Leica CM1900冷冻切片机。
  16. 当OCT变为白色后，可将持样器安装至切片装置上，并至少等待30分钟，使温度达到平衡。
  17. 连续切片，厚度为10 μm，注意观察标记位置，并经常在显微镜下检查神经球切片。尽可能将多个切片转移至同一载玻片上。注意在显微镜下可能无法立即看到神经球的最初几个切片，因此应收集所有切片，直至观察到细胞为止，并保留从首次观察到细胞前的3–5个切片以及神经球末端的切片。这些前段和后段切片也将用于免疫细胞化学处理。因此，在进行免疫染色时，进行核复染至关重要，这有助于检测在标准倒置相差显微镜下不易察觉的神经球极部的单个细胞。
  18. 将切片储存于-20°C条件下。

3. 免疫细胞化学

  1. 从-20°C取出载玻片，轻轻滴加nPBS覆盖所有切片，室温孵育5分钟以解冻。
  2. 轻弹去除多余的 nPBS，立即加入用抗体缓冲液（含 0.3% Triton X-100 和 0.3% 牛血清白蛋白的 nPBS，pH 7.2）稀释的一抗。每张载玻片约需 100 μL。在本实验方案中，我们对三维神经球培养体系中离散的神经前体细胞子代中的 Cx29 进行定位。
  3. 用封口膜覆盖切片，封口膜大小应与载玻片一致，不可超出载玻片边缘；若封口膜达到或超过载玻片宽度，抗体将通过渗透作用被吸离载玻片。封口膜可防止液体蒸发。将载玻片置于湿盒中，4°C 过夜孵育。覆盖封口膜时应轻柔地使其悬浮于切片上方，避免与载玻片直接粘连。但一旦放置完毕，不得移动或调整封口膜位置，以免对切片施加剪切力，导致组织形态结构受损。
  4. 向切片直接加入约 1 mL nPBS，使 Parafilm 漂浮脱落。或者，将载玻片垂直放入 Coplin 染色缸中，直至 Parafilm 自行漂离。在 Parafilm 尚未自然脱离前，切勿人为移除，以免破坏脆弱的神经球结构。一旦 Parafilm 从载玻片上脱落，于室温孵育 5 分钟。弃去 nPBS，再于室温下用 nPBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
  5. 在湿盒中，按照上述方法加入用抗体稀释液稀释的二抗，室温孵育1小时。每张载玻片约需100 μL。
  6. 重复第4步中的nPBS洗涤。在3中加入细胞核复染剂rd 用含0.5 μg/mL Hoechst 33258的nPBS洗涤5分钟，随后在室温下进行最后一次5分钟洗涤。
  7. 使用您选择的抗荧光淬灭封片剂封片，并先用指甲油在盖玻片四角固定，再沿边缘完整封边，以防封片剂流失（若使用基于甘油的封片剂）。
  8. 使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜进行图像采集。本实验方案中采用 Leica DMRA2 显微镜、Hamamatsu Orca ER 相机和 OpenLab v3.56 软件。本示例中，图像在三个通道上采集：（1）相差通道，（3）蓝色紫外光通道（Leica A4 滤光片组：激发滤光片 360/40，分色镜 400，发射滤光片 BP470/40），以及红色通道（Leica Y3 滤光片组：激发滤光片 BP535/50，分色镜 565，发射滤光片 610/75）。拍摄各连续切片时，利用 Hoechst 33258 对 DNA 的标记追踪细胞核极性，特别关注首尾切片，以在单个细胞相位检测困难时确保完整性。

4. 序列比对

  1. 当冷冻切片贴附到显微镜载玻片上时，切片会发生轻微的移动和旋转，这些偏差必须予以校正。此外，在对每张连续切片进行成像时，每幅图像的中心在屏幕上的位置可能并不一致。因此，必须仔细地将每张数字化的连续切片与前一张切片重新对齐，以保持形态结构的准确性。此对齐过程需要精确关注细胞构筑和拓扑细节。
  2. 将各通道的连续图像以及在 OpenLab v3.56 软件中设定的 10 μm 和 50 μm 比例尺，保存为独立的 TIFF 文件，并以 3300 x 2550 像素的标准画布尺寸和 72 像素/英寸的分辨率导入 Photoshop CS4。在此导入过程中，必须仔细确保画布尺寸正确，以维持准确的比例尺。画布尺寸和分辨率对于后续在 Maya 中的建模至关重要。比例尺应作为 Photoshop 中的独立图层保存，用于验证在 Photoshop 中对齐过程中 X-Y 维度未发生任何改变。
  3. 接下来，链接对应于同一张切片的三个（或更多）图层（即，将每张切片的相差、UV 和 Cy3 图像序列分别链接）。这可确保当一个图层对齐时，与该切片相关的其他图层也同时对齐。或者，您也可以在将相差图层置于合适位置后将其锁定（见下文），然后将该切片的其他关联图层对齐至相差图层。
  4. 首先，通过点击图层面板中的“眼睛”图标，使所有图层变为不可见。
  5. 通过点击图层面板中的“眼睛”图标，显示神经球连续切片的第一和第二张相差图像。增加第二张切片的透明度。在“图像”选项卡下，打开“图像旋转”并选择“任意角度”。旋转第二张切片，直到能够在两幅图像之间识别出几何和结构上的连续对应点。此时可交替比对 UV 通道图像（Hoechst 33258 标记的切片）以辅助判断。
  6. 对所有后续连续切片重复此过程，逐一比对“相邻切片”（即前一张切片与后一张切片），直至所有切片及所有通道均准确对齐。
  7. 在 Maya v10 中创建一个与 Photoshop 文件具有相同比例的平面。

5. 细胞类型学

  1. 在 Maya 用户界面的状态栏中，将菜单栏从默认的 Animation（动画）设置更改为 Surfaces（曲面）。
  2. 使用基本的细分球体创建细胞主体。
  3. 选中神经球后，通过在对象上单击鼠标右键并从标记菜单中选择 Vertex（顶点），开始操纵其顶点。通过在标记菜单中更改显示级别，进一步细化球体表面。
  4. 在主菜单的 Subdivision Surfaces（细分曲面）选项卡中，打开 Collapse Hierarchy（塌陷层级）选项窗口，并将层级数设置为 2，然后对球体进行塌陷。
  5. 将菜单栏从 Surfaces（曲面）更改为 Polygons（多边形）。
  6. 选中球体后，从主菜单的 Mesh（网格）选项卡中打开 Sculpt Geometry Tool（雕刻几何工具）。
  7. 利用 Tool Settings（工具设置）选项卡中的 Sculpt Geometry（雕刻几何）工具集，将细胞表面精修至最终形态。
  8. 重复此过程以创建不同的细胞体，模拟神经球中存在的多种神经前体细胞（NPC）及其子代细胞。在本示例中，共创建十个不同的细胞体作为神经球的基础。
  9. 选中细胞类型并执行冻结变换（Freeze Transformations）。
  10. 在确定细胞类型后，将设计两种表面着色器，分别表示表达目标蛋白的细胞（在本例中为 Cx29 阳性细胞）以及不表达该蛋白的细胞。此处，任何显示 Cx29 免疫反应性的细胞均被定义为 Cx29 阳性细胞。本示例中未建模亚细胞定位，尽管通过修改着色器可实现此类分析。
  11. 从主菜单的 Windows > Rendering Editors（渲染编辑器）选项卡中打开 Hypershade 窗口。
  12. 从表面材质选项卡中选择一个渐变着色器（Ramp Shader）。
  13. 打开属性编辑器（Attribute Editor），设置着色器的颜色（Color）、自发光（Incandescence）、环境光颜色（Ambient Color）、凹凸贴图（Bump Map）和高光颜色（Specular Color）属性。
  14. 将布朗运动 3D 纹理（Brownian 3D Texture）分配给环境光颜色节点，将 2D 分形纹理（2D Fractal Texture）分配给凹凸贴图节点。
  15. 选择生成的着色器的输入与输出连接，并导出所选网络。
  16. 选中细胞类型，打开“导出所选内容”选项窗口。
  17. 选择文件类型为 mayaAscii，并取消勾选“包含这些输入”选项框，然后执行导出所选内容操作。

6. 细胞作图

  1. 在 Photoshop CS4 中打开对齐的连续切片文件。
  2. 建立铅笔笔触的图例，用于标记每个前体细胞在连续切片中的位置。在本演示中，使用三种笔触图例——实心方块、带虚线的方块和带十字的方块，分别表示细胞出现在一个、两个或三个切片中。该笔触图例还通过颜色进一步定义——本例中，红色代表表达目标蛋白 Cx29 的细胞，白色代表不表达 Cx29 的细胞。
  3. 打开相位层，并使用白色铅笔笔触标记每个前体细胞的中心位置。在切片文件夹内使用单独的图层来构建您的图谱。
  4. 在各切片之间切换，定位细胞位置，确保跨多个切片的细胞被正确标注。
  5. 打开 Cx29 层，选择位于 Cx29 正常表达区域内的细胞。
  6. 在 Photoshop 主菜单栏的“编辑”选项卡中选择“填充”命令，将白色笔触更改为红色。
  7. 完成图谱绘制后，将每个切片另存为独立的 JPEG 图像，保存至 Maya 项目的 sourceimages 文件夹中。为此，需首先创建一个新的 Maya 项目。

7. 在三维空间中导入和组装地图

  1. 在 Maya 用户界面的状态栏中，将菜单栏从默认的 Animation（动画）模式更改为 Polygons（多边形）模式。
  2. 从项目 scenes（场景）文件夹中导入 planes.mb 和 scaleBar.mb 文件。
  3. 选中平面后，通过在对象上单击鼠标右键并打开 Assign New Material（指定新材质）选项卡，为其分配 Lambert 材质。
  4. 在属性编辑器中，点击材质 Color（颜色）属性右侧的棋盘格方块。
  5. 在弹出菜单中，从 2D Textures（二维纹理）部分选择 File（文件）。
  6. 在属性编辑器的 File Attributes（文件属性）部分，点击 Image Name（图像名称）属性右侧的文件图标。
  7. 从 sourceimages（源图像）文件夹中选择第一张切片图像。
  8. 通过打开 Panels（面板）选项卡，将工作区窗口的摄像机从 Perspective（透视）视图切换至默认的正交 Top（顶）视图。
  9. 从主菜单的 Mesh（网格）选项卡中选择 Create Polygon Tool（创建多边形工具），并沿切片轮廓描边。
  10. 从 sourceimages 文件夹中选择第一张地图图像，并按照创建多边形平面的既定步骤，将其分配给新创建的多边形平面。
  11. 选中对象后，在平面上单击鼠标右键，从标记菜单中选择 UV。
  12. 选中所有平面的 UV 点，并从主菜单的 Windows（窗口）选项卡中打开 UV Texture Editor（UV 纹理编辑器）。
  13. 按比例缩放 UV，使其适配切片平面。
  14. 对神经球的每一层切片重复此过程，确保各切片之间的间距与标尺的高度相对应。

8. 在三维空间中定位前体细胞类型

  1. 在 Maya 用户界面的状态栏中，将菜单栏从默认的 Animation（动画）切换至 Dynamics（动力学）。
  2. 仅保留神经球的第一个切片可见，通过主菜单中 Display（显示）选项卡下的显示设置，隐藏其余所有切片。
  3. 打开 CV 曲线工具的选项窗口，在 CV 曲线设置中选择 1 Linear（线性）。
  4. 从 Top（顶视图）摄像机视角查看场景，开始在细胞图谱上分配点，分别为 Cx29 阴性细胞和 Cx29 阳性细胞创建一条曲线。
  5. 从 Side（侧视图）摄像机观察时，生成的曲线是扁平的。参考从显微图像导入的比例尺，沿 y 轴方向移动曲线上点的位置，以确定切片的厚度。
  6. 对神经球的每个切片重复此过程。
  7. 从项目 scenes 文件夹中导入 cellTyoplogy.ma 文件，并在神经球内为 Cx29 阴性细胞和 Cx29 阳性细胞分别复制细胞类型学模型。
  8. 从主菜单的 Windows > Rendering Editors（渲染编辑器）选项卡中打开 Hypershade 窗口。
  9. 导入先前构建的着色器，并将其分配给类型学中的细胞。
  10. 在 Outliner（大纲视图）窗口中，删除导入对象名称开头的文件名。这在建模过程的后续阶段将变得重要。
  11. 从主菜单中选择 Particles（粒子）选项卡，并为第一条 CV 曲线创建一个粒子发射器。
  12. 打开 particleShape1 选项卡，在 Emission Attributes（发射属性）下将 Max Count（最大数量）从 -1 更改为第一条曲线上点的数量。
  13. 在 Render Attributes（渲染属性）选项卡中，将粒子渲染类型更改为 Blobby Surface (s/w)（团状表面）。点击下方的 Current Render Type（当前渲染类型）框，将粒子半径设置为 0.010。
  14. 首先选择粒子，然后按住 Shift 键选择曲线，将粒子绑定到曲线的顶点上。在主菜单的 Particles 选项卡中打开 Goal（目标）选项，将 Goal Weight（目标权重）设为 1，然后点击 Create（创建）。
  15. 在 Outliner 窗口中按顺序选择编号 1 至 10 的细胞，然后从主菜单的 Particles 选项卡中打开 Instancer (Replacement)（实例化器（替换））选项窗口。在 Instance Objects（实例对象）框中，应按顺序列出全部十个细胞。
  16. 从 Particle Object to Instance（要实例化的粒子对象）下拉列表中选择正确的 particleShape 名称，点击 Create（创建）。
  17. 默认情况下，仅最初选中的第一个细胞会沿曲线替换粒子。为了使全部十种细胞类型随机出现并循环分布于粒子之间，需要编写表达式。第二个表达式将确保每次重新定位时间滑块时，细胞均以相同方式随机发射。
  18. 选中发射器后，打开属性编辑器（Attribute Editor）。在 particleShape 选项卡中，点击 Add Dynamic Attribute（添加动态属性）下的 General（通用）框。在 Long Name（长名称）中输入 random_index。将 Attribute Type（属性类型）从 Scalar（标量）更改为 Per particle (array)（每个粒子（数组）），然后点击 Add（添加）。
  19. 在 Per Particle (Array) Attributes（每个粒子（数组）属性）选项卡中已添加 random_index 框。在空白区域单击鼠标右键，从下拉菜单中选择 Create Expression...（创建表达式）。
  20. 在 Expression（表达式）框中输入以下文本：particleShape1.random_index=rand(10); if (particleShape1.particleId==1)seed(1);
  21. 完成表达式后，打开属性编辑器中的 Instancer (Geometry Replacement)（实例化器（几何体替换））选项卡，在 General Options（通用选项）> Object Index（对象索引）下拉列表中选择 random_index。将时间滑块移至第一帧并播放，此时细胞类型已随机分布在粒子之间。
  22. 对神经球的每个切片重复此过程。确保每个新的发射器、实例化器和随机索引在名称上有所区分，并在 Outliner 窗口中适当组织。

9. 渲染 / 合成

  1. 在“渲染设置”窗口的“使用渲染器”部分，将渲染器从 Maya 软件更改为 mental ray。
  2. 打开“质量”选项卡，在光线追踪部分将“反射”设置更改为零。打开“帧缓冲区”选项卡，将“Colorclip”从“Raw”更改为“Alpha”，并取消勾选“Premultiply”。
  3. 打开“通道盒/图层编辑器”，将图层编辑器的设置从“Display”更改为“Render”。
  4. 选择导入的拓扑结构细胞，点击“创建新图层并指定所选对象”图标。
  5. 将该图层重命名为 ambient occlusion。
  6. 在新创建的图层上单击鼠标右键，从菜单中选择“Attributes”。
  7. 在 renderLayer 框右侧，点击“Presets”按钮，然后从下拉列表中选择“Occlusion”。
  8. 选择 mib_amb_occlusion1 选项卡，将“Samples”从 16 更改为 256。
  9. 重新打开“通道盒/图层编辑器”，在“Options”选项卡下，打开“Render All Layers”选项框。
  10. 选择“Composite”并保留图层。
  11. 选中 ambientOcclusion 图层后，从图层列表上方的下拉框中将其混合模式从“Normal”更改为“Multiply”。
  12. 对神经球进行两次渲染：第一次开启 ambientOcclusion 图层，第二次开启 masterLayer 图层。将图像保存为 iff 文件，存入项目图像文件夹中。
  13. 在 Photoshop CS4 中打开这两幅图像。将 ambientOcclusion 图层置于 masterLayer 之上，并将其混合模式设为 Multiply。创建背景图层并合并图像。

讨论

本实验方案描述了一种培养出生后海马神经前体细胞（NPCs）并进行连续冷冻切片的方法，通过免疫检测定位蛋白表达，并最终重建和分析整个三维神经球中免疫阳性细胞的拓扑位置。通过结合细胞生物学的培养与处理技术、显微成像（OpenLab、Improvision 及其他图像分析软件）、图形编辑软件功能（Adobe Photoshop）以及三维动画与合成软件功能（Autodesk Maya），我们提出了一种方法，能够从连续的二维图像重建三维培养物的全部细胞组成，从而真实还原神经球培养中细胞的位置及蛋白表达情况。该方案可同样有效地用于共聚焦厚切片的荧光透射显微图像（Z-stacks）或荧光薄切片的图像配准与重建。由于在神经球培养中单个NPC的克隆扩增重现了出生后大脑神经发生和胶质发生过程中所观察到的多个阶段，其三维结构对暴露于相同实验环境中的子代细胞命运具有重要影响1。连续神经球切片核心与外围在谱系分化和蛋白表达上的差异表明，细胞位置、机械应力和剪切力等多种物理因素在调控NPC生物学行为中发挥重要作用2。此外，本文所分析的连接蛋白（connexin）表达已被证明会因NPC在悬浮状态下的三维神经球培养或在层粘连蛋白基质上贴壁培养而发生变化；细胞是否在塑料基质或三维悬浮培养中生长，会影响连接蛋白介导的功能性细胞通讯3。细胞位置对NPC命运的影响尚不明确。由于对谱系和信号通路蛋白的抗原检测需要破坏三维结构以实现细胞通透性和抗体对所有细胞的可及性，因此在技术上难以分析三维培养内部空间位置对NPC生物学的影响。本文展示了一种混合可视化方法，可用于确定特定蛋白在三维培养中是否具有独特的位置分布，推断并验证蛋白功能及其在神经球区域内定位的调控机制，更重要的是，提供研究三维拓扑结构和细胞定位对NPC命运影响所必需的位置数据。

披露

所有动物实验均按照渥太华大学动物护理委员会和加拿大动物护理委员会制定的指南和规定进行。

致谢

感谢 Evan Dysart 和 Marc Léonard 在视频制作与编辑方面提供的专业技术支持，感谢 Matt Cooke 在数据收集方面的协助，以及 Sarah Gelbard 提供的专业编辑帮助。本研究由加拿大卫生研究院（CIHR, MOP 62626）向 SALB 提供的运营基金、SALB 和 SF 共同获得的加拿大卫生研究院健康研究战略培训计划资助（神经退行性脂质组学培训计划，TGF 9121），以及加拿大创新基金会和安大略省创新信托基金向 SF 提供的基础设施支持。SI 获得了安大略省研究生奖学金（科学与技术领域），该奖学金由帕金森研究联盟提供部分资助。NV 获得了老龄化研究所和加拿大卫生研究院神经退行性脂质组学培训计划的毕业后专业研究员奖学金。我们衷心感谢 AutoDesk Research 提供的教育软件和技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
戊巴比妥试剂Merck & Co.
Krazy Glue试剂Home Hardware
VT1000S 振动切片机设备Leica Microsystems
神经蛋白酶试剂Sigma-AldrichP6141储存液保存于 -20°C
木瓜蛋白酶试剂Sigma-AldrichP4762储存液保存于 -20°C
DNase I试剂Roche Group11 284 932 001储存液保存于 -20°C
MZ6 解剖显微镜设备Leica Microsystems
ProBlot 6 杂交炉设备Labnet International
Centrifuge 5702 离心机设备Eppendorf
kPBS试剂BioShop CanadaPBS404
B27 添加剂试剂Invitrogen17504-044
超低吸附组织培养皿耗材Corning3261
人表皮生长因子试剂Invitrogen13247-051储存液保存于 -20°C
成纤维细胞生长因子-2试剂Invitrogen13256-029又称碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）
储存液保存于 -20°C
37% 甲醛（分子级）试剂Sigma-AldrichF8775
Belly Dancer 摇床设备Stovall Life Sciences, IBI Sciences
Tissue-Tek 冷冻模具耗材Sakura Finetek4566
Tissue-Tek OCT 包埋剂试剂Sakura Finetek4583
Whatman Grade 703 印迹滤纸耗材VWR international28298-020
CM1900 冷冻切片机设备Leica Microsystems
多克隆抗 Cx29 一抗试剂由哈佛医学院 David Paul 博士惠赠以 1:1 甘油溶液保存于 -20°C
Cy3 标记的驴抗兔 IgG试剂Jackson ImmunoResearch以 1:1 甘油溶液保存于 -20°C
H–chst 33258试剂Sigma-Aldrich861405
DMRA2 正置荧光显微镜，Orca ER 相机，OpenLab v3.56设备/软件Leica Microsystems本方案可使用任何正置荧光显微镜或共聚焦显微镜完成。
Photoshop CS4软件Adobe图像处理软件
Maya v10软件Autodesk建模软件
计算机设备Intel处理器：Intel Core i7 920，内存：12GB DDR3
显卡：Nvidia GTX 285（1GB 显存）

* 协议中列出的所有其他标准化学试剂均来自 Sigma-Aldrich。所有其他标准组织培养试剂均来自 Invitrogen。

参考文献

  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
  2. Campos, L. S. Neurospheres: insights into neural stem cell biology. J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).
  3. Imbeault, S. The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells. BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).

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