小鼠唾液腺干细胞的分离

摘要

本文介绍了一种从小鼠唾液腺中分离干细胞的优化方案。该方法结合酶消化与机械消化，可分离获得含有具有干细胞特征细胞的唾液腺球状体（salispheres）。

摘要

人类和小鼠成熟的唾液腺至少包含五种细胞类型，每种细胞均参与唾液的生成并将其排入口腔。浆液性和黏液性腺泡细胞分别是腺体中蛋白质和黏液的生产单位，是唾液生成的起始部位。一旦合成，唾液中的各种酶类及其他蛋白质成分便通过一系列具有上皮样形态的导管细胞进行分泌，最终经由一条主要导管排入口腔。在此过程中，导管细胞还会对唾液的成分进行修饰。

在干燥综合征等疾病的发生过程中，以及头颈部癌症的放射治疗等某些临床情况下，唾液腺的唾液分泌量显著减少^1,2。由此产生的口干症（主观感受到的口腔干燥）不仅影响患者吞咽和说话的能力，还会促进龋齿的发展，对患者的社会生活造成严重困扰。

因此，在上述临床状况下恢复唾液分泌代表了一项尚未满足的临床需求，已有若干研究证明唾液腺具有再生能力^3-5。继从小鼠和人体多种组织中分离出具有干细胞特性的细胞群体之后^6-8，我们通过所述方法证实，从小鼠唾液腺中分离的干细胞可用于恢复经辐射损伤的唾液腺的唾液分泌功能^9,10。这一发现为开发基于干细胞的疗法以治疗人类口干症提供了可能，同时也为进一步探索唾液腺作为含有具有多向分化潜能和自我更新能力细胞的微环境奠定了基础。

方案

1. 试剂的配制

1. 缓冲液：1 % (w/v) 牛血清白蛋白的 Hank's 平衡盐溶液
2. 重悬酶。透明质酸酶：40 mg/mL，溶于缓冲液中；胶原酶 II：23 mg/mL，溶于缓冲液中。每次分离均需使用新鲜配制的酶溶液。溶解后，于 4 °C 保存，用于后续消化。
3. 50 mM 氯化钙水溶液。使用 0.2 μm 孔径滤器过滤除菌。
4. 小鼠唾液腺（MSG）培养基：DMEM:F12 培养基，含青霉素（100 I.U./mL）、链霉素（100 μg/mL）、谷氨酰胺（2 mM）、表皮生长因子-2（20 ng/mL）、成纤维细胞生长因子-2（20 ng/mL）、N2 添加剂（1 %）、胰岛素（10 μg/mL）和地塞米松（1 μM）。

2. 机械法与酶解法组织消化

1. 称量解剖得到的唾液腺组织。
2. 在小型培养皿中，使用无菌弯头解剖剪将腺体组织切碎成均匀的浆状物。
3. 将切碎的组织收集至14 mL离心管中，每80 mg下颌下腺组织加入1 mL缓冲液。用部分缓冲液冲洗培养皿，确保组织完全转移。
4. 每80 mg组织再加入1 mL缓冲液，随后分别加入25 μL胶原酶II酶溶液、25 μL透明质酸酶酶溶液和250 μL氯化钙溶液。若处理大量组织，为方便操作，步骤2.4–2.9可在T25细胞培养瓶中进行。
5. 置于37 °C振荡水浴中孵育20分钟。取出离心管，用移液器吹打混匀，使酶液充分与组织混合。
6. 再次放回水浴中继续孵育20分钟。
7. 以400 × g离心8分钟收集组织，弃去上清液。
8. 每80 mg组织用2 mL缓冲液重悬，并按上述方法重复加入酶溶液和氯化钙溶液。在振荡水浴中孵育20分钟。取出离心管，用移液器吹打混匀，确保酶充分混合。
9. 最后在振荡水浴中继续孵育20分钟。按上述方法离心收集细胞，弃去上清液。

3. 洗涤步骤

1. 将每份80 mg组织重悬于2 mL缓冲液中，用移液器吹打洗涤，以去除酶。
2. 按前述方法离心收集，弃去上清液。
3. 每80 mg组织用1 mL缓冲液重复洗涤一次，离心收集，弃去上清液。

4. 过滤

1. 每 80 mg 组织用 1 mL 缓冲液重悬组织溶液。
2. 将溶液加入置于 50 mL Falcon 管上的 100 μm 孔径滤器中。每个滤柱中加入的剪碎组织溶液不得超过 3 mL，以免滤器堵塞。让溶液自然渗滤。用移液器收集滤器底面悬挂的滤过物质，并加入滤液中。
3. 使用带 26 号针头的注射器从 50 mL 管中吸取滤液，然后加至 5 mL 管上的 50 μm 孔径滤器中。让其自然过滤，必要时可稍微松开管盖以促进过滤。
4. 按前述条件离心收集细胞。弃去上清液。

5. 铺板与培养基

1. 将所有沉淀合并为一个体积，使用自动细胞计数器或血细胞计数板进行计数。
2. 以每孔 0.4 × 10⁶ 个细胞的密度将细胞接种至 12 孔板中，或以每瓶 T25 培养瓶 2.67 × 10⁶ 个细胞的密度接种。每孔加入 1 mL MSG 培养基，每只 T25 培养瓶加入 6 mL。
3. 在 37 °C 条件下培养。至第 2 天时，细胞球应清晰可见。

6. 代表性结果：

培养两到三天后，培养物中将出现细胞小聚集体（唾液腺球）。唾液腺球在培养期间可持续增大，十天内可明显观察到其生长。图1展示了唾液腺球的代表性相差显微镜图像。这些球体中可分离出表达干细胞相关标志蛋白的增殖细胞，最佳分离时间为分离后的第3至第5天，这些细胞具有分化为功能性唾液分泌性腺泡细胞的能力。

图1. 唾液腺球体形成 体外在使用本方案进行机械和酶消化后，可在悬浮培养物中观察到尺寸逐渐增大的球状结构。各图为代表性的相差显微镜图像，分别显示培养第0天（A）、第4天（B）、第7天（C）和第10天（D）的球状结构。比例尺 = 50 μm.

讨论

此处描述的组织培养方法是一种可重复的实验方案，用于从小鼠唾液腺中分离含有干细胞的唾液腺球体。采用此方法分离的细胞所开展的研究已揭示了唾液腺干细胞的再生能力。 ⁹移植100个来源于涎腺球的c-Kit+细胞可诱导辐照小鼠涎腺功能恢复。这些数据令人振奋，为开展基于干细胞治疗口干症的研究提供了起点。然而，仍有许多方向有待探索，包括干细胞的完整标志蛋白表达谱、下颌下腺是否能够挽救辐照后腮腺的功能（反之亦然），以及假定的 体内 细胞的干细胞微环境。最终，将该方案应用于人类组织样本，并利用分离出的细胞治疗人类患者的口干症，是所述方法最具前景的应用方向。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H3506	于 – 20 °C 保存
胶原酶 II	GIBCO，由 Life Technologies 生产	17101-015	于 4 °C 保存
表皮生长因子-2	Sigma-Aldrich	E9644	用磷酸盐缓冲液（PBS）配制成 10 μg / mL 的储存液。分装成单次使用量，于 – 20 °C 保存。
成纤维细胞生长因子-2	Sigma-Aldrich	F0291	用 PBS 配制成 25 μg / mL 的储存液。分装成单次使用量，于 – 20 °C 保存。
N2 添加剂	GIBCO，由 Life Technologies 生产	17502-048	按照生产商说明书操作。
胰岛素	Sigma-Aldrich	I6634	用自来水配制成 2 mg / mL 的储存液。溶解前，用冰醋酸将水调节至 pH 2–3。
地塞米松	Sigma-Aldrich	D4902
孔径为 100 μM 的无菌细胞筛	BD Biosciences	352360
带细胞筛帽的聚苯乙烯圆底管（孔径 50 μM）	BD Biosciences	352235