本文描述了一种灵活且高效的方法，用于表征特定细胞类型中蛋白质的定位及核质穿梭。该异核体方法利用荧光标记的融合蛋白，在细胞融合后对蛋白质定位进行成像。该方案适用于稳态下的定位分析，也可结合活细胞成像用于更动态的过程研究。
本文内容
摘要
摘要
大量蛋白质受到细胞内区室转运或核质穿梭的调控。这些蛋白质具有多种多样的细胞功能，包括RNA和蛋白质的核输入/输出、转录调控以及细胞凋亡。值得注意的是，许多重要的细胞重组过程，如细胞分裂、分化和转化，通常涉及此类活动3,4,8,10。由于引发这些定位变化的刺激因素往往难以捕捉，且蛋白质本身的移动过程可能高度动态而难以追踪，因此对这些蛋白质及其调控机制的深入研究具有挑战性。例如，在细胞癌变相关研究中，持续揭示正常原代细胞与转化细胞之间不同的信号通路及蛋白质活性，有助于加深对该过程的理解6,7,11,12。由于许多蛋白质在细胞转化过程中或因转化而发生定位改变，因此开发高效表征这些蛋白质及其参与通路的方法，将有助于加深对癌变机制的认识，并为药物靶点的发现开辟新的方向。
本文介绍了一种用于分析原代和转化哺乳动物细胞间蛋白质转运与穿梭活性的方法。该方法结合异核体融合的生成与荧光显微镜技术，提供了一种灵活的实验方案，可用于检测蛋白质的稳态或动态定位。如图1所示，将两种不同的细胞类型分别瞬时转染含有目的基因与荧光蛋白基因连接的质粒构建体。转染后，利用聚乙二醇诱导细胞融合，随后可通过多种方法对蛋白质的定位进行成像观察。本文所述方案为基础性方法，可在此基础上添加特定技术进行拓展。
方案
1. 细胞系转染
转染方法 1
（使用Lonza核转染技术提高原代细胞转染效率）
- 转染前，细胞应为近期传代且处于对数生长期。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并通过胰酶消化法收集细胞。
- 以1500 × g离心5分钟收集细胞。
- 将灭菌的盖玻片放入6孔板中。可根据需要对盖玻片进行包被以增强细胞贴附。每孔加入1.5 mL培养基（本实验中为含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基），并将培养板置于培养箱中平衡。
- 通过胰酶消化法收集细胞，并用少量磷酸盐缓冲液（PBS）重悬。
- 计数细胞，并离心适量的细胞悬液，使每份样品含有约5×105个细胞。
- 每份样品用100 μL室温的Nucleofector溶液小心重悬细胞。
- 将100 μL细胞悬液与5 μg质粒DNA混合，小心转移至Nucleofector比色杯中，避免产生气泡。
- 选择合适的Nucleofector程序（可能需要预先测试以确定最佳转染效率并尽量减少细胞死亡率）。
- 将含有细胞/DNA悬液的比色杯插入Nucleofector比色杯架中，并启动所选程序。
- 程序完成后，取出比色杯，并向其中加入约500 μL预平衡的培养基（取自6孔板）。
- 立即转移样品至6孔板中，每孔终体积为1.5 mL。细胞可按混合群体或单独接种，以设置对照。
转染方法 2
（Qiagen Effectene 细胞系转染）
- 使用Qiagen Effectene试剂制备转染复合物：首先将0.8 μg的每种质粒DNA样品加入200 μL EC缓冲液中。
- 向每个样品中加入6.4 μL增强剂试剂，通过轻弹管壁短暂混匀，并在室温下孵育2分钟。
- 向每个样品中加入20 μL Effectene试剂，轻弹管壁混匀，并在室温下孵育15分钟。
- 在孵育期间，准备两种目标细胞系用于转染。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤近期传代的细胞（<80%汇合度）一次，然后重新加入1.5 mL新鲜预热并平衡的生长培养基（本实验中为Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）含10%胎牛血清（FBS））。
- 转染复合物孵育15分钟后，向每个样品转移1.2 mL培养基，用移液器吹打混匀，立即向6孔板中的两个孔各加入约700 μL复合物溶液，逐滴加入，并通过轻轻旋转培养板混匀。让细胞转染至少3小时（可根据细胞类型有所变化）。
- 将灭菌的盖玻片放入新的6孔板中。可根据需要对盖玻片进行包被以增强细胞黏附。
- 细胞转染完成后，用PBS洗涤细胞两次，并通过最小程度的胰酶消化收集细胞：向每个孔中加入约100 μL胰酶溶液，轻轻振荡培养板使溶液充分覆盖孔底，立即吸除胰酶。待细胞脱落后，加入1.5 mL新鲜培养基。
- 此时，应将细胞以混合或分离的群体形式（对照组）接种至灭菌的盖玻片上。
- 让细胞恢复培养12小时。
2. 细胞融合
- 移除细胞的培养基，并用 PBS 洗涤两次。
- 此时建议用环己酰亚胺（100 μg/mL）处理细胞，以抑制蛋白质合成。将细胞孵育 2 小时，然后用 PBS 洗涤两次。
- 将细胞暴露于含 50% 聚乙二醇 1000（PEG 1000）的无血清 DMEM 溶液中，在室温下作用 125 秒，以诱导细胞融合。
- 用 PBS 洗涤细胞以去除 PEG 1000 溶液，并加入 2 mL 新鲜预热并平衡过的培养基。
- 让细胞孵育 18 – 24 小时。
荧光显微镜
- 移除培养基，用 PBS 洗涤细胞两次。
- 每孔加入 1 mL 4% 多聚甲醛溶液（溶于 PBS），固定细胞，轻轻振荡 15 分钟。
- 用 PBS 洗涤固定后的细胞两次。
- 小心从培养板中取出盖玻片，吸去多余的 PBS，然后倒置贴附于载玻片上，载玻片上预先滴加一滴封片剂（含 DAPI 的封片液：90% 甘油，100 mM Tris pH 7.5，2% DABCO（1,4-二氮杂双环辛烷））。
- 去除载玻片上多余的封片剂，用指甲油封固盖玻片。
- 通过共聚焦显微镜或落射荧光显微镜观察细胞。
3. 代表性结果
图2展示了一个使用原代成纤维细胞和H1299非小细胞肺癌细胞的异核体实验示例。本实验中关注的蛋白质（鸡贫血病毒VP3）在原代细胞类型中主要定位于细胞质，而在转化细胞类型中则定位于细胞核，这一现象通过落射荧光显微镜观察得到证实。该蛋白在原代包皮成纤维细胞（PFF）中以与GFP融合的形式表达（pEGFP-N1载体，Clontech），在H1299细胞中则以与dsRed融合的形式表达（dsRed-N1载体，Clontech）。对照样本为同源融合（最上面两行），显示为多核细胞，且稳态定位模式未发生改变。此类改变可能因对融合条件敏感或合胞体形成而发生。异核体融合（最下面一行）表明，来源于原代细胞的GFP融合蛋白进入细胞核，并与来源于转化细胞的dsRed融合蛋白发生共定位，提示转化细胞成分的引入引发了定位变化。图中所示为一种相对罕见的由两种细胞各一个融合而成的异核体，其特征是同时存在两种荧光蛋白信号。除了检测此类定位转变外，还可通过观察单一荧光蛋白在两个细胞核中的存在来轻松检测核质穿梭活性。在分析1:1细胞融合时，这种判断尤为明确，且需依赖于蛋白质翻译的抑制。
图 1. 使用原代成纤维细胞和 H1299 非小细胞肺癌细胞的异核体实验方法流程图。 将目的基因克隆至两种荧光蛋白基因之一，形成同框融合。随后将两种构建体分别瞬时转染至细胞系中，并给予恢复时间。通过短时间聚乙二醇（PEG）处理诱导异核体形成，再进行进一步孵育。最后，利用多种荧光显微镜技术观察目的蛋白的亚细胞定位。
图2. 通过异核体融合可视化鸡贫血病毒VP3蛋白的核质运输与穿梭活性。上排：表达dsRed-VP3的自融合H1299细胞的代表性图像。中排：经PEG融合后表达GFP-VP3的原代包皮成纤维细胞（PFF）的代表性落射荧光图像。下排：PFF细胞与H1299细胞的异核体融合。黄色表示GFP与dsRed信号的共定位。细胞使用Leica AF6000E荧光显微镜及Leica成像软件进行成像。
讨论
本文介绍的异核体实验方案提供了一种高效且易于解读的方法，用于表征细胞类型特异性的定位行为以及核质穿梭活性。该方法利用了荧光分析的高灵敏度，以及对活细胞进行成像并研究蛋白质动态过程的能力。该技术可轻松适用于多种不同类型的细胞，并可用于活细胞和固定细胞的成像。例如，可采用倒置荧光显微镜进行活细胞成像和时间序列视频采集。相比之下，贴附的细胞则可用于落射荧光显微镜分析稳态下的定位情况，或通过共聚焦显微镜对特定亚细胞定位进行更精细的成像。此外，还可结合光漂白后荧光恢复（FRAP）或光漂白过程中荧光丢失（FLIP）等技术，用于研究定位动力学1。在本方案中引入不同的荧光染料，可同时开展蛋白质相互作用实验，例如荧光共振能量转移（FRET）分析2。此外，还可使用多种细胞转运抑制剂，如Leptomycin B或显性失活型Ran GTP酶构建体，以确定特定核输入或核输出通路的依赖性5,6,9。
- 在涉及穿梭活性的某些实验中，必须注意避免因新蛋白合成而导致的定位效应。在此类情况下，应使用翻译抑制剂或限定时间点。然而，翻译抑制可能带来的假象仍需警惕。对于穿梭和定位行为的清晰解读，最理想的是包含每种细胞类型各一个的细胞融合体。可能需要优化细胞数量和融合条件（时间与浓度），以促进此类理想的1:1融合事件。
- 需要注意的是，根据所使用的特定细胞类型，实验方案中某些步骤的优化是必要的。实验过程中诸如融合效率、转染效率以及融合后细胞存活率等参数在不同细胞类型之间可能存在显著差异。特别是原代细胞，由于培养条件复杂且转染效率较低，操作难度较大。使用如Lonza Nucleofector等技术可实现细胞的快速处理，并显著提高转染效率。此外，电穿孔方法便于将悬浮状态的细胞直接转入后续的融合步骤。
致谢
我们感谢伍斯特理工学院化学与生物化学系提供的资金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Effectene 试剂 | Qiagen | 301425 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| 胰蛋白酶 | Fisher Scientific | SH3023602 | |
| Dulbecco’s 修饰 Eagle’s 培养基（DMEM） | Fisher Scientific | SH30243FS | 高葡萄糖 |
| 对甲醛 | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Hyclone 血清（胎牛） | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3008803HI | |
| Falcon 6 孔板 | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 聚乙二醇 1000 | Fisher Scientific | 528875-25GM | |
| 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | |
| Nucleofector HDF 试剂盒 | Lonza Inc. | VPD-1001 |
参考文献
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