利用声学膜微粒技术开发定制的中国仓鼠卵巢宿主细胞蛋白检测方法

摘要

本文介绍了在ViBE平台上开发定制化检测方法，以在复杂基质中获得更灵敏、可重复且自动化的检测结果。通用型试剂盒可轻松将检测方法适配用于定制化检测。这种灵活性支持新型检测方法的快速开发与验证，或对现有手动检测方法进行自动化改造，本视频中将对此进行示例展示。

摘要

针对独特蛋白质的定制检测通常局限于耗时的手动检测与定量技术，例如ELISA或Western印迹，这是由于在其他平台上开发此类检测的复杂性所致。BioScale公司专有的声学膜微粒（Acoustic Membrane MicroParticle, AMMP）技术可轻松开发用于ViBE平台的夹心免疫测定法，具有更高的灵敏度、更好的重复性以及自动化操作优势。本文以开发定制的中国仓鼠卵巢宿主细胞蛋白（CHO-HCP）检测为例，详细说明其实验方案。此处概述的一般原则可广泛适用于多种免疫测定方法的开发。

AMMP 检测法通过测量微粒结合到传感器表面所引起的振荡频率变化来测定抗原浓度。该方法包含四个主要组分：（1）含有功能化八通道传感器芯片的试剂盒；（2）带有抗体标记的磁性微粒；（3）带有半抗原标记的抗体，可结合至功能化芯片表面；（4）含有目标抗原的样本。BioScale 的生物传感器是一种共振装置，包含八个具有独立流体通路的独立膜。当表面有质量沉积时，膜的振荡频率会发生改变，通过检测该频率变化即可定量所增加的质量。

为了便于在多种免疫分析中使用，该传感器通过固定抗半抗原抗体进行功能化。针对特定分析的抗体经过修饰：其中一个抗体通过共价偶联连接半抗原标签，另一个抗体则连接生物素。生物素标记用于将抗体结合至链霉亲和素偶联的磁珠，该磁珠与半抗原标记的抗体共同作用，通过夹心法捕获待测分析物。该复合物通过抗半抗原抗体与半抗原之间的相互作用结合到芯片上。每次分析运行结束后，传感器用稀酸清洗，从而实现对96孔板中各列样品的连续分析。

本文介绍了为生物工艺开发建立定制化CHO-HCP AMMP检测方法的流程。开发AMMP检测方法或将现有检测方法改造为AMMP检测，可在复杂样品中实现更优的性能（如重现性和灵敏度），并减少操作人员的操作时间。本方案详细说明了方法建立的具体步骤，讨论部分则对代表性结果进行了评述。如需深入了解检测优化和定制化参数，请联系BioScale。该试剂盒提供多种通用的生物工艺开发检测方法，包括残留蛋白A检测、产物滴度检测和CHO-HCP检测。

方案

1. 微粒制备

1. 使用生物素-NHS化学法标记抗体
2. 测定生物素标记程度
3. 将链霉亲和素磁珠与生物素化抗体偶联
   1. 通过涡旋震荡1-2分钟，重悬原瓶中的磁珠
   2. 将所需体积的磁珠分装至微量离心管中
   3. 用PBST洗涤磁珠3次：
      1. 将含有磁珠的离心管置于磁力架上静置2分钟
      2. 在磁力架上小心吸去上清液，避免扰动磁珠
      3. 将离心管从磁力架上取下，加入1 mL PBST
      4. 涡旋震荡20秒以重悬磁珠
      5. 离心5秒，使附着在管盖上的磁珠沉降至管底
      6. 重复步骤2.3.1至2.3.5共两次
   4. 第三次洗涤后，将离心管置于磁力架上，吸去PBST
   5. 向磁珠中加入生物素化抗体并重悬
   6. 如有需要，用PBS将生物素化抗体体积补至300 μL；若抗体体积已超过300 μL，则不再添加PBS
   7. 将磁珠/抗体悬浮液在室温下于涡旋振荡器或管式旋转仪上孵育30分钟
   8. 按步骤3的方法用PBST洗涤3次
   9. 用生物素化BSA封闭磁珠
      1. 第三次洗涤后，加入10 μg/mg生物素化BSA，必要时用PBS调节体积至300 μL，并在震荡条件下孵育30分钟
   10. 按步骤3的方法用PBST洗涤3次
   11. 将磁珠重悬于100 μL PBS/0.05% BSA中。如需长期保存，可加入叠氮化钠
4. 按照标准的NHS荧光素标记方案，对检测抗体进行荧光素标记
5. 测定荧光素标记程度

2. HCP - 发展

1. 配制工作液：
   1. 荧光素标记抗体（Fl-Ab）：大多数CHO-HCP检测中，Fl-Ab的终浓度为400 ng/mL。Fl-Ab的添加量为最终检测体积的1/4，因此其工作液浓度应为1.6 μg/mL。使用BioScale Bead/FlAb稀释液稀释Fl-Ab原液来配制该工作液。
   2. 微球：大多数CHO-HCP检测中，微球的终浓度为2×10⁵ 个微球/mL。微球试剂占最终检测体积的1/4，因此其工作液浓度为8×10⁵ 个微球/mL。使用BioScale Bead/FlAb稀释液稀释微球原液来配制该工作液。在取样前需充分涡旋震荡微球原液，确保所有微球均匀悬浮。
   3. 运行缓冲液：运行缓冲液的组成可能需要根据用于开发检测方法的抗体进行优化，但已有多种CHO-HCP检测采用含10 mM HEPES缓冲液、1% Tween、pH 7.5的缓冲体系。BioScale已开发出一种运行缓冲液添加剂（随开发试剂盒提供），在使用前需将其加入缓冲液中，终浓度为1%。
2. 使用BioScale样本稀释液稀释校准品和样本。

3. ViBE 系统设置

1. 打开 ViBE 工作站
2. 连接系统的供液和废液管路
3. 对系统进行预灌注
4. 插入 ViBE 试剂盒（ViBE Cartridge）
5. 布设管路
6. 通过填写标有“样品设置”（Sample Setup）的表格来准备检测模板。BioScale 可为每次 ViBE 工作站检测提供一个独立的检测模板，允许用户在模板的“备注”（Notes）表格中编辑并保存特定检测的相关注释，从而完整记录实验过程。
7. 初始检测模板设置：首先在“样品设置”（Sample Setup）表格的左上角填写该检测中标准品的浓度范围。
8. 接下来，在标准品右侧的表格中（包括简单列读取设置、单试剂添加和双试剂添加设置）输入附加信息，以指示 ViBE 工作站样品需要孵育多长时间、转移多少体积的试剂、样品积累需要持续多久，以及是否需要进行传感器调节、探针和试剂盒的去污染等操作。
9. 填写微孔板布局。
10. 将样品/试剂加入微孔板中。ViBE 将提供试剂板所需的体积。样品体积可变，但建议以总检测体积 120 μL 的一半作为起始参考。
11. 加盖板膜，将微孔板加载至工作站平台。
12. 运行检测启动向导，按照向导步骤完成操作并开始检测。

4. 典型结果

图 1：AMMP 夹心免疫分析法

在 ViBE 工作站上，AMMP 检测用于测定抗原浓度。当珠-抗原-半抗原抗体通过半抗原/抗半抗原相互作用与传感器结合时，产生检测信号。再生步骤通过去除免疫复合物使传感器恢复至初始状态。

图 2：CHO-HCP AMMP 检测的标准曲线

图2上方为CHO HCP AMMP检测分析法的标准曲线示例。该方法可用于纯化流程中各阶段样品（包括反应器样品）的分析，具有高精确度和良好的重复性。

图3：蛋白质A AMMP检测法的标准曲线

图3是使用VIBE残留蛋白A检测试剂盒进行的残留蛋白A AMMP检测的校准曲线。同一试剂盒可用于孵育时间为30分钟的快速检测，也可通过延长孵育时间获得更高灵敏度和更宽动态范围的结果，且不会损失精密度或准确度，这两项性能通常优于用户手中的等效ELISA方法。

图4：产品滴度AMMP检测

ViBE 工作站还可用于产物滴度检测，结果如图4所示。与其它AMMP检测不同，该检测无需除简单稀释以外的样品处理步骤，也不需要使用微珠；已在含有超过一千万个细胞且细胞活力范围广泛的“无离心”样品中验证了定量的准确性。

图 5：GST-Gadd34 生物标志物检测的 AMMP 检测标准曲线

图5显示了使用ViBE BioAnalyzer（图A）或AlphaScreen技术对重组GST-Gadd34蛋白检测所获得的信号标准曲线。在使用相同抗体的情况下，ViBE平台的检测灵敏度大约高出一个数量级。AMMP通过测量更少但更大的颗粒实现检测，同时仍可受益于溶液相中的捕获和检测复合物的形成。

图6：肿瘤样本中GST-Gadd34的AMMP检测标准曲线

在图6中，通过ViBE BioAnalyzer（图A）或AlphaScreen（图B）分析，检测了CWR22异种移植瘤中Gadd34的诱导情况，检测过程在存在或不存在硼酸盐蛋白酶体抑制剂的条件下进行。ViBE平台能够在体内肿瘤异种移植模型中产生灵敏且可重复的结果，而AlphaScreen信号则随着蛋白质量（μg）的增加而被淬灭。

本示例展示了AMMP技术在高度复杂样本中的强大能力。由于检测芯片的高灵敏度以及芯片附近磁体的高效率，即使少量磁性微粒也能在裂解细胞（包括裂解试剂）和血液碎片的复杂环境中，高效且可重复地捕获低丰度的目标物质。

讨论

上述示例展示了AMMP在复杂样品中具有高度灵敏的定量结果。当试剂的配制过程具备简便性和可控性时，该性能可支持多种应用。这些应用可以针对特定目标物，例如肿瘤中的Gadd34；也可以适用于广泛的目标物谱系，例如在贯穿纯化流程的样品中对宿主细胞蛋白进行检测与定量。低运行成本的ViBE平台与高度灵活的AMMP相结合，为实现关键检测提供了强大工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NHS-显色生物素或NHS-显色生物素标记试剂盒
若购买NHS-Chromogenic-biotin作为试剂，则需准备以下额外材料
与水混溶的有机溶剂，例如二甲基亚砜（DMSO）或二甲基甲酰胺（DMF）
磷酸盐缓冲液（PBS）或其他无胺缓冲液（pH 7 – 9)
用于缓冲液置换的脱盐柱或透析装置
能够测量 354 和 280 nm 的分光光度计 – 用于测定蛋白质和生物素浓度
生物素标记抗体（每抗体2-5个生物素）
链霉亲和素磁珠	BioScale		(10 mg/mL) 约108 beads/mg
微型离心管磁铁	New England Biolabs	货号 # S1510S
用于封闭的生物素化BSA
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
PBS 0.1% 吐温 20
涡旋混合
用于涡旋振荡器或试管旋转器的微型离心管架
待标记的抗体或蛋白质
NHS-荧光素或 NHS-荧光素标记试剂盒
如果购买NHS-荧光素作为试剂，则需要以下额外材料
与水混溶的有机溶剂，如二甲基亚砜（DMSO）或二甲基甲酰胺（DMF）
50 mM 硼酸盐，pH 8.5，或其他无胺缓冲液（pH 7 – 9)
用于缓冲液置换的脱盐柱或透析装置
测量蛋白质和荧光素浓度需要能够检测 493 和 280 nm 波长的分光光度计。
稀释液	BioScale		稀释珠子和FlAb
样品稀释液	BioScale		用于稀释样本和校准品
运行缓冲液添加剂	BioScale