使用具有透气材料技术的 HYPERStack 器具进行封闭式细胞培养的方案

摘要

介绍用于高产量贴壁细胞培养的康宁HYPERStack培养容器及其配件的技术、操作流程和使用方法。本操作流程将展示如何利用封闭式系统容器，相较于现有的堆叠式培养板产品，提高细胞收获量。

摘要

当微载体小球不是最佳选择时，大体积贴壁细胞培养目前普遍采用多层板式细胞生长产品。HYPERStack 器具可在封闭系统中实现从现有堆叠板产品的放大培养，并在相同体积占用空间下提供超过 2.5 倍的细胞产量。HYPERStack 器具通过透气材料发挥作用，允许气体交换，从而无需容器内部预留气相空间。由于无需气相空间，细胞生长区域可被最小化以节省空间，从而在相同的体积占用空间内容纳更多层的细胞生长表面积。

对于细胞治疗或疫苗生产等多种应用，细胞培养和收获过程需要使用封闭系统。HYPERStack 培养装置可通过连接培养基袋或其他方式的管路，实现细胞和试剂的添加与移除。

本方案将介绍HYPERStack培养容器中所用透气材料的技术原理、满足细胞代谢需求的气体扩散结果、封闭系统中的细胞培养方案以及多种收获方法。

方案

1. HYPERStack 培养容器——透气材料技术背景

1. HYPERStack 培养器是一种多层结构的密闭系统培养容器，用于细胞培养，其通过一层76.2微米厚的透气性聚合物膜实现气体交换，以支持细胞代谢。
2. HYPERStack 培养器与传统细胞培养容器的不同之处在于，容器内部细胞上方没有“顶空”结构。该系统不依赖容器内部的“顶空”进行气体交换，而是通过每个培养腔下方开放于大气中的空气通道（称为“气管”空间）实现气体交换。
3. 这种气管空间可确保培养器中每个细胞培养区室内的细胞获得均等的气体交换条件。
4. 透气膜在维持无菌环境的同时允许气体交换。所有多层结构的液体操作均通过单一入口完成。

2. HYPERStack 培养容器组件概述

1. Stackette 是由顶板和透气膜组成的独立细胞培养腔室，细胞在此腔室内进行培养。
2. Liquid Manifold 将 HYPERStack 模块内的 12 个 Stackette 层连接在一起，模块之间通过管路连接，可形成 multiples of 12 层的培养容器。该管路系统使用户能够对整个容器进行一次性的液体操作。
3. Air Manifold 同样用于连接各个 Stackette 层，但在添加液体时用于排出容器内的空气。其内部设有填充管路，用于填充过程中的操作。
4. Tracheal Space 是各 Stackette 层之间的开放空气空间，通过每层的透气膜实现气体交换。
5. Liquid handling tubing 连接至液体管路系统，用于执行所有封闭系统的液体操作，该组件可根据需要进行定制。
6. Vent tubing 连接至空气管路系统，内置空气过滤器，用于在保持无菌条件的同时释放多余空气。
7. chase tubing 配备过滤器和夹具，连接至液体操作管路，用于在填充容器后将液体操作管路中的液体排空。
8. Corning Stack Manipulator（CSM）是一种操作装置，用于在使用过程中协助将容器准确放置到指定位置。
9. Filling Wedge 是一种不锈钢辅助工具，用于手动填充 HYPERStack 容器时的操作辅助。

3. HYPERStack 培养容器中所用透气膜的气体扩散结果

1. 在传统的带通气顶空的细胞培养系统中，培养3天后，培养基中的氧气平均消耗50%。（图1）
2. 在同一细胞培养系统中，培养基液面高度为3 mm时，培养基与顶空交界处的氧梯度比细胞层处高出近50%。（图2）
3. 氧气通过76.2微米厚的透气性聚苯乙烯膜的扩散速率相当于通过2.6 mm培养基的扩散速率。HYPERStack培养容器中使用的透气膜可使气体交换直接发生在细胞层水平。
4. 随着细胞生长至汇合，HYPERStack容器内气道空间中的氧气百分比保持恒定。（图3）

4. 培养基袋制备

1. HYPERStack-12 层培养容器需加入 1.3 L 培养基，HYPERStack-36 层培养容器需加入 3.9 L 培养基。
2. 在接种装有培养基的袋子之前，如果需要使用血清，应通过管路焊接将血清袋与培养基袋连接，并充分混合。
3. 使用大型袋夹在培养基袋中夹闭约 300 mL 培养基。这可确保接种的所有细胞在灌装过程中均被使用，而不会残留在培养基袋中。将培养基袋放置于支架上。

5. 接种培养基

1. 用连接导管的注射器吸取细胞悬液。将含有细胞悬液的注射器上的3/16"导管焊接到培养基袋上。
2. 将细胞悬液注入培养基袋中，并充分混匀。

6. 填充步骤

1. 将接种后的培养基袋通过管路焊接连接至HYPERStack容器的3/8英寸液体操作管路。（也可使用无菌连接器或多功能连接器（MPC）将培养基袋连接至容器。）
2. 关闭HYPERStack上液体操作管路和冲洗管路的夹具。
3. 将HYPERStack 36层容器置于CSM的装载位置；将通气滤膜管钩入CSM上的固定夹中。拧紧盖子，并将CSM移至填充位置。将容器置于正确的填充位置后，空气滤膜处于最高点，可在填充过程中防止润湿。10°的倾斜角度有助于在填充过程中使液体在各层之间平衡分布。将HYPERStack-12层容器侧放于填充楔块上，即为正确的填充位置。
4. 通过将培养基袋置于与HYPERStack容器相同高度（不可更高）来排出填充管路中的空气。保持冲洗管路夹具关闭状态，打开液体操作管路夹具和培养基袋夹具，使液体流入容器中。
5. 使用培养基袋支架抬高培养基袋，以促进细胞悬液流入容器。
6. 持续填充容器，直至所有接种的培养基均进入容器内，此时培养基袋顶部应仍保留约300 mL培养基。移除培养基袋上的夹具以继续填充容器。当液体接近上部空气歧管时，通过降低培养基袋高度来减缓填充速度，以防止过度填充。缓慢将液面升至填充线处，随后夹闭液体操作管路。

7. 将液体锁定在各层中的分离步骤

1. 将 CSM 中的 HYPERStack 器皿移至隔离位置，使两组管路均处于最高位置，并将培养基袋降至低于器皿的高度。可通过一手扶住器皿侧面，另一手提起加样楔的方式，将 HYPERStack-12 层器皿抬升至隔离位置。
2. 保持追洗滤器处于直立状态，打开追洗管夹，使液体输送管路中的培养基回流至培养基袋中。待管路排空后，关闭培养基袋管路上的管夹。
3. 保持追洗管滤器直立，打开 HYPERStack 上液体输送管路的管夹，使残留液体流入器皿并达到平衡。等待 1–2 分钟完成此过程。
4. 将 CSM 中的 HYPERStack 器皿旋转，使管路位于左侧，随后将器皿降至 CSM 的装载位置。轻微向左倾斜 HYPERStack-12 层器皿，即可取出加样楔。关闭追洗管和液体输送管上的管夹。
5. 此时可将培养基袋从器皿上移除，也可保持连接，以备后续收获步骤使用。若需保存连接的培养基袋，应将空袋及袋内残留培养基卷起，并置于 HYPERStack 器皿储存托盘的固定带下方。
6. 将 HYPERStack 器皿转移至培养箱。搬运过程中应注意防止液体进入通气滤膜。可通过将 HYPERStack 的管路端略微向上倾斜来实现这一目的。

8. 收获方案

1. 开始收获操作时，将细胞解离溶液袋和淬灭液袋通过管路焊接连接，形成收获袋组件。确保所有管夹均处于关闭状态。（可用示意图演示）
2. 从培养箱中取出 HYPERStack 器具，松开固定带下的培养基袋，将其悬挂在支架上。将器具放入细胞收获系统（CSM）的装载位置，并拧紧盖子以固定器具。将通气管路钩入固定夹中，然后将 CSM 移至灌注位置。
3. 确保支架上的培养基袋位置低于 HYPERStack；打开培养基袋管路和器具液体处理管路上的管夹，使培养基流入连接的收集袋中。
4. 当器具内液体排空约四分之三时，将 CSM 设置调整至最终排空位置。当 HYPERStack 器具及液体处理管路完全排空后，抬高管路以推动残余液体越过废培养基袋管路上的管夹，随后关闭液体处理管路和废培养基袋管路上的两个管夹。
5. 用收获袋组件通过管路焊接替换废培养基袋，并使用支架将细胞解离液袋组件抬升至高于 HYPERStack 的位置。
6. 将 CSM 置于平衡位置。打开细胞解离溶液管路上的管夹，将溶液转移至 HYPERStack 中。转移完成后，关闭液体处理管路和细胞解离溶液管路上的管夹。
7. 将 CSM 移至装载位置。保持水平定位杠杆打开状态，通过转轮轻轻左右摇动器具，使溶液均匀分布于细胞层表面。在摇动过程中，可偶尔将器具返回平衡位置，以维持溶液的均匀分布。尽管肉眼可能难以判断各层是否完全覆盖，但解离溶液将在细胞表面均匀分布。当溶液充分分布后，释放 CSM 上的杠杆，将 HYPERStack 锁定在装载位置。在细胞所需的解离时间内，保持 HYPERStack 处于该位置。
8. 当细胞完成脱落时，以浊度变化为参考，将 CSM 移至平衡位置。注意避免细胞过度消化。打开淬灭液袋管夹和 HYPERStack 液体处理管夹，使淬灭培养基进入器具。转移完成后，关闭 HYPERStack 液体处理管路上的管夹。
9. 将 CSM 返回至装载位置，并保持水平定位杠杆打开，摇动器具使其左右摆动。
10. 使用支架将收获袋组件的位置降至低于 HYPERStack 水平。调节 CSM 至排空位置，打开器具液体处理管路上的管夹，将细胞悬液回流至淬灭液袋中。将 CSM 返回至装载位置，并使用管路封口器断开收获袋组件与器具的连接。细胞悬液现已准备就绪，可进行后续处理。

9. 典型结果

• 当从标准聚苯乙烯表面转换为透气性聚苯乙烯表面时，需要优化收获时间。在HYPERStack产品上，细胞通常释放得更快。
• 在显微镜下观察细胞时，需夹闭通气管和液体操作管路。将HYPERStack培养装置倒置，使歧管朝下，放置在显微镜载物台上。
• 可采取预防措施以避免使用过程中滤膜被润湿，否则会导致滤膜失效。避免过度填充HYPERStack培养装置，并在夹子打开时保持通气管和冲洗管路处于抬高位置，即可防止润湿发生。
• 夹紧的夹子对管路施加的压力会导致管路在夹子打开后仍保持闭合状态。用手反向捏压管路即可将其打开。
• 通过重力进液方式，培养基进入和离开HYPERStack培养装置的流速取决于HYPERStack装置内培养基液面与培养基容器内液面之间的高度差。高度差越大，流速越快。最大流速受滤膜额定值限制，为1.5 L/min。
• 保持HYPERStack培养装置内适当的填充体积，可防止细胞生长腔室中形成气泡。由于取样或在未加湿环境中培养导致水分蒸发损失，可能产生气泡。取样量和频率以及培养条件将决定最终用户是否需要额外补充液体。

图1. 标准细胞培养容器中培养基的氧气消耗情况。该图显示了3天内细胞水平处氧气浓度（mg/L）的下降趋势。

图 2. 标准细胞培养容器中培养基内的氧气梯度。该图显示，在培养基与顶空交界处的氧气浓度（mg/L）高于细胞层处。

图 3. HYPERStack 细胞生长过程中气管腔内的氧气百分比。该图显示，在96小时期间，各层之间的氧气百分比保持恒定，从而为每层透气膜底部提供稳定的气体供应。这表明细胞在生长至汇合过程中能够持续获取氧气。

讨论

HYPERStack 培养容器已成功培养了工程细胞、原代细胞和干细胞。向容器中添加液体可通过无菌袋连接以重力流加液，也可通过从无菌培养基容器中泵送实现。该容器相比具有相同体积占地的堆叠培养板产品，其生长面积增加了2.5倍以上。HYPERStack-12 的生长面积为 6,000 cm²，HYPERStack-36 为 18,000 cm²，HYPERStack-120 则达到 60,000 cm² 的生长面积。通过增加表面积，用户能够从相同的细胞群体或批次中获得更多的细胞，并减少实验变异性。同时，用户还能通过使用更少的容器达到相同的细胞产量，从而节省空间和/或人力；或在不增加人员、洁净室区域或培养箱的情况下提高细胞产量。该系统采用低微粒生成的组装工艺制造，且不使用粘合剂。它是一个封闭系统，预装了管路组件和滤器，经三层包装，提供无菌状态。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5L 袋装培养基	Lonza Inc.	TBD	1350ml 培养基 + 150ml 血清（如需要）
4.0L 袋装培养基	Lonza Inc.	TBD	3600ml 培养基 + 400ml 血清（如需要）
HYPERStack 培养容器-12	Corning	10012
HYPERStack 培养容器-36	Corning	10036
灌注楔块	Corning	10040
堆栈操作器	Corning	TBD
HyQtainer 子组件取样装置	Hyclone	SH3B0324.01
600ml 袋装培养基淬灭液（10% FBS IMDM）	Lonza Inc.	TBD
600ml 细胞解离溶液	Lonza Inc.	TBD