用钙离子指示剂加载果蝇神经末梢

摘要

钙是神经系统中一种普遍存在的信号分子，对于触发神经递质释放和突触强度的改变至关重要。本文中，我们演示了一种将Ca²⁺指示剂载入果蝇神经末梢的技术。同时，我们还展示了所需装置的制作过程，并强调了该技术成功实施的关键要点。

摘要

钙在神经系统中具有多种作用，其中最引人注目的作用是作为神经递质释放的触发因子，而最深远的作用则是作为支持学习与记忆的突触可塑性所必需的信号分子。为了进一步阐明依赖Ca²⁺的突触机制的分子基础，需要一个既具有遗传可操作性又具备生理可及性的模型系统。黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）正是这样一个理想的模型。在此系统中，已有可遗传编码的荧光指示剂用于检测神经末梢中的Ca²⁺变化。然而，这些指示剂对Ca²⁺的敏感性有限，且常表现出非线性响应。相比之下，合成荧光指示剂更适合于测量与神经活动相关的快速Ca²⁺变化。本文展示了一种将葡聚糖偶联的合成Ca²⁺指示剂加载到活体果蝇幼虫神经末梢的技术。特别强调了该实验方案中对技术成功最为关键的几个方面，例如如何避免沿分离神经产生静电放电、在长时间加载过程中维持样本的生理状态，以及通过提供Ca²⁺促进切断轴突末端的封闭以确保轴突存活。目前已有一些低亲和力的葡聚糖偶联Ca²⁺指示剂（如fluo-4和rhod）可供使用，它们在最小干扰突触前Ca²⁺动态的同时，展现出较高的信噪比。葡聚糖偶联有助于防止Ca²⁺指示剂被隔离至线粒体等细胞器内。该加载技术可同样适用于果蝇幼虫、胚胎及成虫。

方案

1. 选择一个干净的解剖皿，确保未接触任何固定剂。
   
   
2. 在含有 Ca²⁺ 和 L-谷氨酰胺的 Schneider's 果蝇培养基中解剖一只游走期 3^rd 龄果蝇幼虫（切勿切断任何神经或损伤第 7、6、13 或 12 号肌纤维）。
   
   
3. 选择一支尖端内径为 12 微米的玻璃填充移液管。
   
   
4. 使用注射器和管路（以对移液管施加负压），确保移液管尖端无堵塞。
   
   
5. 选择一根细塑料填充丝，可插入玻璃移液管全长。
   
   
6. 将约 1 厘米长的 5 mM 右旋糖酐偶联 Ca²⁺ 指示剂吸入塑料填充丝中。
   
   
7. 切断所有体节神经。
   
   
8. 将移液管置于斜坡支架上，使移液管尖端可接近解剖后幼虫的腹侧中线。
   
   
9. 在不夹捏神经的前提下，将第 4 体节神经的切断端引入移液管末端（包含少量 Schneider's 培养基）。
   
   
10. 移除管路，并将塑料填充丝插入移液管，直至其末端距离神经切断端约 50 微米（避免触碰神经）。
    
    
11. 向神经末梢排出足够的 Ca²⁺ 指示剂，使 Schneider's 培养基体积增加约 33%（最终浓度应< 2 mM）。重要提示——此步骤必须在切断神经后 5 分钟内完成。
    
    
12. 将标本置于室温避光环境中，使神经完成染料负载。
    
    
13. 40 分钟后，使用填充丝移除 Ca²⁺ 指示剂。
    
    
14. 保持移液管位置不变，并将其完全充满新鲜 Schneider's 培养基，后续将用于向神经施加刺激脉冲。
    
    
15. 在开始 Ca²⁺ 成像前，让 Ca²⁺ 指示剂在神经中平衡至少 60 分钟，但不超过 4 小时。
    
    
16. 在平衡过程中，每隔 30 分钟用新鲜 Schneider's 培养基冲洗标本一次。
    
    
17. 成像前 20 分钟，将 Schneider's 培养基替换为类血淋巴溶液 No.6（HL6；Macleod 等，2002；2003）。
    
    
18. 可在 HL6 溶液中添加 7 mM 的 L-谷氨酸或谷氨酸盐，以使突触后谷氨酸受体脱敏，防止神经诱发的肌肉收缩（Macleod 等，2004；Reiff 等，2002；2005）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Schneider’s 昆虫培养基	试剂	Sigma-Aldrich	S0146	必须含有 L-谷氨酰胺和钙
L-谷氨酸单钠盐水合物	试剂	Sigma-Aldrich	G1626